23-丁二醇對細胞周期的影響

2，3-丁二醇對細胞周期的影響 概述：了解白酒酒體中各風味物質對人體健康的影響，提高白酒酒體中功能活性物質的含量，降低酒體中有害成分已成為今后研究的一個重要方向。1緒論1.1研究背景世界六大蒸餾酒之一——白酒，是中國獨有的蒸餾酒。從古至今，中國白酒因其獨特濃郁的風味受到中國乃至世界人民的喜愛。隨著人民日益增長的物質文化需要到人民日益增長的美好生活需要的轉變，健康在美好生活中的地位不容忽視，越來越多的人開始關注白酒對人體健康的影響。傳統(tǒng)認為白酒有活血通脈、增進食欲、消除疲勞等功效。研究表明飲用少量低度白酒可以擴張小血管，可使血液中的含糖量降低,促進血液循環(huán)，延緩膽固醇等脂質在血管壁的沉積，對循環(huán)系統(tǒng)及心腦血管有利。然而白酒中含有大量具有獨特風味的微量物質，這些物質雖然在白酒總體中含量較低，但種類繁多、成分復雜，因此需要大量的科學研究才能最終得出白酒對人體健康的影響。原發(fā)性肝癌（primacylivercancer，PLC）作為全球范圍內較為常見的惡性腫瘤疾病之一，在我國有著較高的臨床發(fā)病率，且呈逐年上升趨勢房達,趙乾,杜寧,等.肝癌放,射介入治療患者輻射劑量的分析［J］.首都醫(yī)科大學學報，2020，41（3）：454-457.DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2020.03.024.。我國PLC的主要危險因素是乙型肝炎病毒（HBV）的感染，隨著酒精性肝病成為第二肝病病因，僅次于病毒性肝炎，飲酒與PLC的關系也越來越受到重視孫曉艷，王炳元.飲酒與肝癌[J].現代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（7）：1007.。Meta分析結合不同研究結果合并后得出計飲酒的合并OR值為1.87，表明飲酒是原發(fā)性肝癌的危險因素，可增加患原發(fā)性肝癌的風險李輝，劉詩義，劉健，等.飲酒和HBsAg與肝細胞肝癌的關聯(lián)性研究[J].醫(yī)藥論壇雜志，2015，36（5）：12-13.。房達,趙乾,杜寧,等.肝癌放,射介入治療患者輻射劑量的分析［J］.首都醫(yī)科大學學報，2020，41（3）：454-457.DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2020.03.024.孫曉艷，王炳元.飲酒與肝癌[J].現代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（7）：1007.李輝，劉詩義，劉健，等.飲酒和HBsAg與肝細胞肝癌的關聯(lián)性研究[J].醫(yī)藥論壇雜志，2015，36（5）：12-13.傳統(tǒng)上人們經常將白酒與有害健康以及酗酒等問題相聯(lián)系，而往往忽略了白酒復雜酒體體系中對健康有益并可以減輕酒精傷害的另一部分微量成分徐巖,范文來,葛向陽,等.科學認識中國白酒中的生物活性成分[J].釀酒科技,2013(9):1-6.DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2013.09.001.。國內外的研究證實了酒類飲料或白酒具有一定的保健作用。Petrick等PETRICK徐巖,范文來,葛向陽,等.科學認識中國白酒中的生物活性成分[J].釀酒科技,2013(9):1-6.DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2013.09.001.PETRICKJL,CAMPBELLPT,KOSHIOLJ,etal.Tobacco,alcoholuseandriskofhepatocellularcarcinomaandintrahepaticcholangiocarcinoma:thelivercancerpoolingproject[J].BritishJournalofCancer,2018,118(7):1005-1012.DOI:10.1038/s41416018-0007-z.1.2白酒中微量物質的研究進展：魏夢嬌魏夢嬌.飲用酒暴露誘導小鼠肝腎組織的毒性效應及其分子機制[D].山西大學,2020.在研究飲用酒暴露誘導小鼠肝腎組織毒性中，引用在相同酒精度數下，單純給予酒精對大鼠肝臟的損傷程度要比飲用酒的嚴重，表明飲用酒內的某些成分可以對抗乙醇對肝臟的損傷,并且通過研究重建小鼠灌胃模型（微量有機組分含量提高的飲用酒干預模型）通過分子機制驗證了飲用酒中這些微量有組分（乙酸、乙酸乙酯、乳酸和乳酸乙酯）可以減輕乙醇誘導肝損傷。因此可以推論出白酒中其他的微量成分也具有研究價值。魏夢嬌.飲用酒暴露誘導小鼠肝腎組織的毒性效應及其分子機制[D].山西大學,2020.白酒中很多微量成分對人體有益，有機酸：沒食子酸可以防治過敏疾病KIMSH,JUNCD,SUKK,etal.Gallicacidinhibitshistaminereleaseandpro-inflammatorycytokineproductioninmastcells[J].ToxicologicalSciences,2006,91(1):123-131.DOI:10.1093/toxsci/kfj063.；阿魏酸有很好的抗氧化能力，具有清除超氧陰離子自由基和抑制脂質過氧化的作用MARIMUTHUS,SUDHEERAR,MENONVP.Ferulicacid:therapeuticpotentialthroughitsantioxidantproperty[J].JournalofClinicalBiochemistry&Nutrition,2007,40(2):92-100.DOI:10.3164/jcbn.40.92.。KIMSH,JUNCD,SUKK,etal.Gallicacidinhibitshistaminereleaseandpro-inflammatorycytokineproductioninmastcells[J].ToxicologicalSciences,2006,91(1):123-131.DOI:10.1093/toxsci/kfj063.MARIMUTHUS,SUDHEERAR,MENONVP.Ferulicacid:therapeuticpotentialthroughitsantioxidantproperty[J].JournalofClinicalBiochemistry&Nutrition,2007,40(2):92-100.DOI:10.3164/jcbn.40.92.乙酸乙酯可以治療乳腺癌張靜,單保恩,劉剛叁,等.香加皮乙酸乙酯提取物誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的研究[J].腫瘤,2006,26(5):418-421;439.DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2006.05.003.、舒張血管蔣惠娣,王玲飛,周新妹,等.杭白菊乙酸乙酯提取物的舒血管作用及相關機制[J].中國病理生理雜志,2005,21(2):334-338.DOI:10.3321/j.issn:1000-4718.2005.02.029.；丁酸乙酯可以穩(wěn)定人的情緒張靜,單保恩,劉剛叁,等.香加皮乙酸乙酯提取物誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的研究[J].腫瘤,2006,26(5):418-421;439.DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2006.05.003.蔣惠娣,王玲飛,周新妹,等.杭白菊乙酸乙酯提取物的舒血管作用及相關機制[J].中國病理生理雜志,2005,21(2):334-338.DOI:10.3321/j.issn:1000-4718.2005.02.029.AZABAN,MEHTADV,CHESEBROJE,etal.Ethylbutyrate,avalproate-likecompound,exhibitsinositol-depletingeffects:apotentialmood-stabilizingdrug[J].LifeSciences,2009,84(1/2):3844.DOI:10.1016/j.lfs.2008.10.016.萜烯物質種類豐富，而且大部分物質如：β-石竹烯、茴香腦、欖香烯和β-桉葉油醇等萜烯類物質具有抗氧化DAHHAMSS,TABANAYM,IQBALMA,etal.Theanticancer,antioxidantandantimicrobialpropertiesofthesesquiterpeneβ-caryophyllenefromtheessentialoilofAquilariacrassna[J].Molecules,2015,20(7):11808-11829.DOI:10.3390/molecules200711808.、抗癌CHAINYGBN,MANNASK,CHATURVEDIMM.Anetholeblocksbothearlyandlatecellularresponsestransducedbytumornecrosisfactor:effectonNF-kappaB,AP-1,JNK,MAPKKandapoptosis[J].Oncogene,2000,19(25):2943-2950.DOI:10.1038/sj.onc.1203614.LIQQ,WANGGD,HUANGFR,etal.Antineoplasticeffectofbeta-elemeneonprostatecancercellsandothertypesofsolidtumourcells[J].JournalofPharmacyandPharmacology,2010,62(8):10181027.DOI:10.1111/j.2042-7158.2010.01135.x.MAEL,LIYC,TSUNEKIH,etal.Beta-eudesmolsuppressestumourgrowththroughinhibitionoftumourneovascularisationandtumourcellproliferation[J].JournalofAsianNaturalProductsResearch,2008,10(1/2):159-167.DOI:10.1080/10286020701394332.等生理學功能，同時也能改善白酒風味。DAHHAMSS,TABANAYM,IQBALMA,etal.Theanticancer,antioxidantandantimicrobialpropertiesofthesesquiterpeneβ-caryophyllenefromtheessentialoilofAquilariacrassna[J].Molecules,2015,20(7):11808-11829.DOI:10.3390/molecules200711808.CHAINYGBN,MANNASK,CHATURVEDIMM.Anetholeblocksbothearlyandlatecellularresponsestransducedbytumornecrosisfactor:effectonNF-kappaB,AP-1,JNK,MAPKKandapoptosis[J].Oncogene,2000,19(25):2943-2950.DOI:10.1038/sj.onc.1203614.LIQQ,WANGGD,HUANGFR,etal.Antineoplasticeffectofbeta-elemeneonprostatecancercellsandothertypesofsolidtumourcells[J].JournalofPharmacyandPharmacology,2010,62(8):10181027.DOI:10.1111/j.2042-7158.2010.01135.x.MAEL,LIYC,TSUNEKIH,etal.Beta-eudesmolsuppressestumourgrowththroughinhibitionoftumourneovascularisationandtumourcellproliferation[J].JournalofAsianNaturalProductsResearch,2008,10(1/2):159-167.DOI:10.1080/10286020701394332.豐富的吡嗪物質很多都是有益成分，如：2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等均具有抗氧化功能孫惜時,李文華,李榮,等.芝麻香型白酒中硫化物和吡嗪類成分的抗氧化活性[J].釀酒,2013,40(4):57-60.DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2013.04.017.，而四甲基吡嗪則是白酒中最為主要的吡嗪物質，它是中藥川穹的主要成分，具有抑制腫瘤FUYS,LINYY,CHOUSC,etal.Tetramethylpyrazineinhibitsactivitiesofgliomacellsandglutamateneuro-excitotoxicity:potentialtherapeuticapplicationfortreatmentofgliomas[J].Neuro-Oncology,2008,10(2):139-152.DOI:10.1215/15228517-2007-051.孫惜時,李文華,李榮,等.芝麻香型白酒中硫化物和吡嗪類成分的抗氧化活性[J].釀酒,2013,40(4):57-60.DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2013.04.017.FUYS,LINYY,CHOUSC,etal.Tetramethylpyrazineinhibitsactivitiesofgliomacellsandglutamateneuro-excitotoxicity:potentialtherapeuticapplicationfortreatmentofgliomas[J].Neuro-Oncology,2008,10(2):139-152.DOI:10.1215/15228517-2007-051.當前報道的白酒中微量成分物質較多，僅定性物質就包括酸類、酯類、醇類、醛類、吡嗪、萜烯等2000多種，其中不乏有多種有益健康的微量成分YAOF,YIB,SHENC,etal.ChemicalanalysisoftheChineseliquorLuzhoulaojiaobycomprehensivetwo-dimensionalgaschromatography/time-of-flightmassspectrometry[J].ScientificReports,2015,5:9553.DOI:10.1038/srep09553.。目前對白酒微量成分的認識還在初級階段，還有很多問題需要進行深入研究。YAOF,YIB,SHENC,etal.ChemicalanalysisoftheChineseliquorLuzhoulaojiaobycomprehensivetwo-dimensionalgaschromatography/time-of-flightmassspectrometry[J].ScientificReports,2015,5:9553.DOI:10.1038/srep09553.1.32,3-丁二醇研究現狀：2，3-丁二醇(2,3-Butanedio1)是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、食品、燃料及航空航天等領域，常溫下是一種無色無味的透明液體戴建英,孫亞琴,孫麗慧,等.生物基化學品2,3-丁二醇的研究進展[J].過程工程學報,2010,10(01):200-208.。戴建英,孫亞琴,孫麗慧,等.生物基化學品2,3-丁二醇的研究進展[J].過程工程學報,2010,10(01):200-208.白酒中呈味物質2，3-丁二醇的形成，主要是在糖化發(fā)酵的后期形成，在這個時期，溫度緩慢降低，糖化發(fā)酵作用較弱，但卻是眾多香味物質生成的時期。2，3-丁二醇是二元醇，但它也具有酮的性質，并有助香作用，在我國名優(yōu)白酒中，含量均較高。2，3-丁二醇主要由多粘菌或賽氏桿菌等發(fā)酵而生成陸壽鵬.釀造工藝[M].2002.陸壽鵬.釀造工藝[M].2002.C6H12O6CH3CHOHCHOHCH3+2CO2+H2尹禮國尹禮國,馮學愚,許德富,.五糧濃香型白酒黃水微量物質分析及應用探討[J].釀酒科技,2014(04):83-85.等采用毛細管柱氣相色譜內標法分析黃水樣品中66種微量成分并與優(yōu)質白酒的微量成分進行了對比分析，其中黃水中含量較高的醇類有6種，其中2,3-丁二醇占總量的87.8%，含量達1.1212g/L，并且優(yōu)質白酒中2,3-丁二醇含量也相對較高，含量達0.0384g/L，占第24位。尹禮國,馮學愚,許德富,.五糧濃香型白酒黃水微量物質分析及應用探討[J].釀酒科技,2014(04):83-85.2,3-丁二醇屬多元醇，具有甜味幾天和助甜基團，也是白酒中甜味的主要來源。瀘香型白酒由于甘油、雙乙酰、2,3-丁二醇含量較高，它們與己酸乙酯配合得當時，構成瀘香型酒的典型香、甜風味刁治民，魏克家，陳占全等.農業(yè)微生物工程學[M].2007.刁治民，魏克家，陳占全等.農業(yè)微生物工程學[M].2007.2,3-丁二醇在餿香型調味酒（驗收后的合格酒，經勾兌成比較全面的基礎酒，在香味或口味的某些方面還有不足。需要通過調味來加以彌補）中的大量存在，可以解決基礎酒的后澀、苦、后味微雜、香味單調等缺陷韓珍瓊主編.釀造食品加工技術[M].2009.韓珍瓊主編.釀造食品加工技術[M].2009.因此探究2,3-丁二醇的影響是有必要的。1.4研究目的及意義：雖然飲用酒對動物肝臟影響有一定的研究，但對白酒中微量物質，上千種微量成分以及雜糅在一起的對人體的綜合效應的研究較少，甚至對2，3-丁二醇在食品健康領域方面的探究少之又少，2，3-丁二醇對肝臟細胞的影響尚不明確。因此提出本課題，其研究的意義在于：用HepG2肝癌細胞，通過檢測氧化應激、細胞衰老、凋亡等反應，來看出不同濃度的2，3-丁二醇對肝臟組織的效應。初步探究2，3-丁二醇對人體健康是否有益。不僅是2，3-丁二醇，白酒中還有很多重要組分需要一一探究并且還要探究復合組分對人體的錯綜復雜的影響，最終在對研究白酒方面提供科學的依據。2材料與方法2.1儀器表2-1儀器Table2-1Apparatus名稱型號生產廠家CO2培養(yǎng)箱Galaxy170RNewBrunswickScientific倒置熒光顯微鏡IX71OlympusCorporation生物安全柜AirstreamA2型EscoMicroPteLtd電熱鼓風干燥箱GZX-9146MBE上海博迅實業(yè)有限公司小型離心機Centrifuge5418Eppendorf高性能臺式離心機X1RThermoFisher超低溫冰箱ThermoScientific核酸蛋白微量檢測儀SpectraMax190MolecularDevices超聲波細胞破碎儀JY88-IIN上海滬析實業(yè)有限公司搖床SLK-O3000-S混勻儀MXW-20DL杭州齊威有限公司電熱恒溫水浴鍋DK-98-II天津泰斯特儀器有限公司冰箱BCD-183KF1TCL家用電器有限公司電泳儀Bio-Rad電子天平AX124ZH/EOHAUS2.2試劑及藥品表2-2試劑及藥品Table2-2ReagentsandMedicines名稱生產廠家DMEM高糖培養(yǎng)基吉諾生物醫(yī)藥胎牛血清（FBS）浙江天杭生物科技青-鏈霉素（雙抗）上海源培生物科技2，3-丁二醇上海易恩化學鐵氰化鉀上海易恩化學X-Gal索萊寶生物科技5-溴-2-脫氧尿苷武漢科瑞生物技術活性氧熒光探針（DFCH-DA）DNA提取酚索萊寶生物科技ProteinaseK北京天根生化溴化乙啶（EB）二甲亞砜（DMSO）噻唑藍（MTT）二甲雙胍維生素C其他試劑：乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（tris堿）、冰乙酸、檸檬酸、H3PO4、K4Fe(CN)6、MgCl2、NaCl、氯仿、異戊醇、乙醇、甲醛、戊二醛、KH2PO4、Na2HPO4、KCl試劑配置：50xTAE：tris堿（三羥甲基氨基甲烷）12.1g、Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）1.86g、冰乙酸2.855mL、去離子水40ml，最終定容至50ml，待用時再稀釋至1xTAEX-Gal染色液：K3Fe(CN)6（100mmol/L）；K4Fe(CN)6（100mmol/L）；X-Gal（20mg/L）；MgCl2（1mol/L）；NaCl（5mol/L）；檸檬酸—磷酸緩沖液（檸檬酸0.1mol/L、磷酸0.2mol/L）磷酸緩沖液（PBS）：KCl（2.7mM）、Na2HPO4（8.1mM）、KH2PO4(1.8mM)、NaCl(137mM)2.3實驗方法：2.3.1實驗分組2.3.2細胞培養(yǎng)2.3.2.1細胞復蘇快速從-80℃超低溫冰箱里取出凍存管，快速放進37℃水浴鍋緩慢搖晃使細胞解凍（凍存管的封口膜不要破裂，防止污染），使用移液槍將1mL細胞全部吸出至10mL無菌EP管，補加9mL基礎培養(yǎng)基稀釋，分裝至1.5mL的無菌EP管中，離心（1000rpm、5min）使細胞沉淀，棄掉上清液。用馬氏管吸取9mL左右基礎培養(yǎng)基，10%胎牛血清，50μl雙抗，輕輕混勻，用吸管將細胞移至培養(yǎng)瓶。平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃、5%CO2），培養(yǎng)24小時后，顯微鏡觀察細胞（貼壁細胞）貼壁后，小心更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，根據不同細胞的生長狀態(tài)進行傳代培養(yǎng)。2.3.2.2細胞傳代細胞長滿90%-100%即可傳代，打開培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)基。加入1mLPBS，潤洗細胞，重復3次，棄PBS。加入4mL基礎培養(yǎng)基，用無菌吸管小心吹打貼壁細胞或者用胰蛋白酶消化細胞使細胞脫落。移液槍轉移1mL脫落的細胞至新的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶中補加8mL基礎培養(yǎng)基，10%胎牛血清，50μL雙抗，小心封口，平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃、5%CO2）2.3.2.3細胞換液：每兩日在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，待長滿視野80％左右即可進行細胞換液，取出培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，馬氏管吸取9mL培養(yǎng)基，根據之前生長情況，適量增加或減少胎牛血清（按經驗，后傳代一般為300~600μL），加入50μL雙抗8字形混勻后，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃、5%CO2）。2.3.3細胞形態(tài)觀察:2.3.4對β-半乳糖苷酶底物染色法研究細胞衰老：取Hepg2細胞（24h、48h）800μL細胞液到1.5mL的ep管中，離心（1500rpm5min）得到細胞沉淀，去除上清液，加500μLPBS到ep管中，用移液槍吹打混勻，取200μL到蓋玻片上，加固定液（2％甲醛）200μL固定10min，用移液槍吸取300μLPBS沖一次，可適當再次用150μL再沖一次，用X-Gal染色液進行染色，充分蓋住細胞，染色1h，在染色過程中放在超凈工作臺開風機盡量吹干相當水分，染色結束棄染液，用少量滅菌水沖開染液，不宜過多容易沖走細胞。統(tǒng)計結果，藍染為陽性，隨機視野取500細胞，統(tǒng)計陽性細胞百分率。2.3.5通過測定Caspase-8活性來研究2，3-丁二醇對細胞凋亡的影響：取Hepg2細胞（24h、8h）1000g、5分鐘收集細胞,吸盡上清。每2~10×106細胞加50~100μL裂解液，放在旋渦混勻器上震蕩裂解，冰浴10分鐘，再次震蕩。4℃、12,000g、10分鐘取上清測定。按表設置96孔板反應體系。底物最后加入以使各管反應起始時間相同,設置不加樣品的空白對照管。置于37℃飽和溫度,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，根據標準曲線計算其含量。Caspase活性增加的百分比=實驗處理組OD/實驗對照組OD*100%反應體系：無樣品空白對照（低酶）活性樣品反應緩沖液μL9560待測樣品μL—35底物μL55總體積μL1001002.3.6DNAladder測定：1.提取細胞中DNA（酚氯仿法）：每組取1mL到EP管中，超聲波破碎細胞（250w15min每破碎3s間隔5s）；Ep管中加入10μL蛋白酶K，放入搖床（56℃1h）；加入等體積tris飽和酚（DNA提取酚）500μL，搖勻10min，離心（12000rpm7min4℃）[上層DNA中層蛋白質下層有機質]；吸取上層液體加入新離心管。配置混合液（tris飽和酚：氯仿：異戊醇=25:24:1）；加入混合液450μL，搖勻10min離心（12000rpm7min4℃）；取上清到新離心管，加等體積（氯仿：異戊醇=24:1）混合液400μL；離心（12000rpm7min4℃）；取上清到新離心管，加2.5倍100％酒精（-20℃預冷）；-20℃過夜取出離心（12000rpm7min4℃）；棄上清留50μL，留白色沉淀（DNA），待酒精揮發(fā)1h，加滅菌水溶解放入2.瓊脂糖凝膠電泳制備瓊脂糖凝膠：用膠帶紙將洗凈干燥的電泳凝膠床的兩端開口封號，形成一個膠膜，平放在工作臺上。配置50xTAE，使用時稀釋到1xTAE，加1％瓊脂糖，放入微波爐內加熱至溶液澄清（100度），取出搖動使瓊脂糖盡快溶解。溶化的瓊脂糖溶液冷卻至不太燙手時，加入溴化乙啶（EB），使其終濃度為0.5μg/ml，充分搖勻；在膠膜放置好梳子后，將凝膠倒入板中等待凝固進行電泳：使用前加入1.5L1xTAE溶液到泳槽，使液面高出凝膠表面1-2mm，將標記物及樣品與上樣緩沖液混合，并以依次加入樣品孔