Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)1(精)

Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)Westernblot實(shí)驗(yàn)步驟

1.組織塊稱重

2.利用液氮、研缽粉碎組織塊

3.加入RIPA緩沖液（每克組織3mlRIPA），PMSF（每克組織30μl，10mg/mlPMSF），利用Polytron進(jìn)一步勻漿（15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4℃

4.加入PMSF（每克組織30μl，10mg/mlPMSF），冰上孵育30分鐘

5.移入離心管4℃約20,000g（約15,000轉(zhuǎn)）15分鐘

6.上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存

7.進(jìn)行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度

8.取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液

9.沸水浴中3分鐘

10.上樣

11.電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA）

12.電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA40分鐘）

13.膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色

14.Westernblot試劑盒顯色

15.分析比較記錄

westernblot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料

1.把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。

1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡。

2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。

3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。

4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。

5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。

6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。

2.將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。

3.用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。

4.膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。

5.室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。

6.用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。

7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。

8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4℃過夜）

9．用總體積300mlPBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。

10．將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。

11．按步驟9洗滌。

12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS），于室溫下?lián)u動(dòng)。

注意事項(xiàng)：

westernblot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于westernblot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行westernblot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。

Western實(shí)驗(yàn)步驟

Western，也稱Westernblot、Westernblotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參

考如下步驟進(jìn)行操作。

1.

收集蛋白樣品(Proteinsamplepreparation)

O可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞

細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒

進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。

O收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要

采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生

O我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子

夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。

O通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過

夜。轉(zhuǎn)膜時(shí)也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時(shí))。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，

需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

O在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

O轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春

紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS膠進(jìn)行染色，以觀察蛋

白的殘留情況。

4.封閉(Blocking)

O轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步

驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

O用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以在

4℃封閉過夜。在整個(gè)Western過程中我們推薦使用碧云天生產(chǎn)的側(cè)擺搖床，側(cè)向擺動(dòng)速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋

白膜。

5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)

O參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。

O用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果

不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。

O回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌

3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)

O參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。

O用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。

O回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌

3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

7.蛋白檢測(Detectionofproteins)

O參考相關(guān)說明書，使用BeyoECL,Western熒光檢測試劑等ECL類試劑來檢測