酶引論優(yōu)秀公開課課件

第9章

酶引論Enzyme一、酶研究的簡史約公元前21世紀夏禹時代,人們就會釀酒。公元前12世紀，周朝已能制作飴糖和用豆類做醬；1810年，GaylussacJ發(fā)現(xiàn)酵母可將糖轉化為酒精；1878年，Kuhne給酶一個統(tǒng)一的名詞,叫Enzyme,希臘文意思是“在酵母中”；1913年，Michaelis和Menten提出米氏方程，酶由定性到定量,奠定了酶學發(fā)展的里程碑；1926年Sumner從刀豆提取出脲酶并獲得結晶,證明其為蛋白質，并提出酶的本質就是蛋白質的觀點。奠定了現(xiàn)代酶學、蛋白質化學的基礎。

薩姆納,J.B.美國生物化學家,1946年獲諾貝爾化學獎

80年代初Cech和Altman分別發(fā)現(xiàn)了核酶(ribozyme),開辟了酶學研究的新領域,1989年共同獲得諾貝爾化學獎。

切赫T.R.Cech（1947－）奧爾特曼S.Altman(1939-)

1986年，Schultz與Lerner研制成功抗體酶；Boyer和Walker闡明ATP合酶合成與分解ATP的分子機制－1997獲諾貝爾化學獎；近20年，飛速發(fā)展，許多酶機制被闡明，已鑒定4000多種酶，數(shù)百種得到結晶。酶的研究成果用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、食品、制革、紡織、日化等部門，很大發(fā)展前途。二、

酶的概念及其作用特點1、酶是一類具有高效率、高度專一性、活性可調(diào)節(jié)的生物催化劑。生物催化劑：酶(enzyme)核酶(ribozyme)

3、

酶催化反應的特點（1）催化效率高酶催化反應速度比非酶催化反應速度至少高出幾個數(shù)量級。（2）高度專一性：酶對反應的底物和產(chǎn)物都有極高的專一性。

（3）易失活，反應條件大多要求溫和：常溫、常壓，中性pH（4）酶活性可調(diào)節(jié)：根據(jù)據(jù)生物體的需要，許多酶的活性可受多種調(diào)節(jié)機制的調(diào)節(jié)，包括：別構調(diào)節(jié)、酶的共價修飾、酶的合成與降解等。二、

酶的化學本質及其組成（一）

酶的化學本質1982年，美國科羅拉多大學博爾德分校的ThomasCech和美國耶魯大學SidneyAltman各自獨立發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能，此發(fā)現(xiàn)被認為是近年來生化領域最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)，此二人分亨1989諾貝爾化學獎?！锖嗣?ribozyme)：具有催化功能的RNA。

（二）

酶的化學組成單純酶類(simpleenzyme)：僅由蛋白質組成，不含其它物質，如脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶等。綴合酶類（conjugatedenzyme)：全酶=脫輔酶+輔因子，二者存在時酶才有催化作用；如超氧化物歧化酶（Cu2＋、Zn2＋）、乳酸脫氫酶（NAD+）

輔酶：與酶蛋白結合較松，可透析除去。如NAD+

，NADP+

輔基：共價鍵，與酶蛋白結合較緊，透析不可除去。如細胞色素氧化酶的鐵卟啉金屬離子：Fe2+、

Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn3+、Mg2+

、K+、Na+

、Co2+等。有機化合物：NAD+

，NADP+

，F(xiàn)AD，生物素，卟啉等酶的輔因子主要有金屬離子和有機化合物，并且根據(jù)與脫輔酶結合的松緊程度不同可分為兩類，即輔酶和輔基。（1）單體酶一般是由一條肽鏈組成，大多是催化水解反應的酶。雞卵清溶菌酶129a.a單鏈

（三）酶的四級締合

（3）多酶復合體由幾個酶靠非共價鍵結合而成，其中每一個酶催化一個反應，所有反應依次進行，構成一個代謝途徑或代謝途徑的一部分。大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復合體由三種酶組成：①丙酮酸脫氫酶（E1）以二聚體存在2×9600②二氫硫辛酸轉乙酰基酶（E2）70000③二氫硫辛酸脫氫酶（E3）以二聚體存在2×56000復合體：

12個E1二聚體24×9600024個E2單體24×700006個E3二聚體12×56000總分子量：460萬三、酶的命名和分類（一）習慣命名1.依據(jù)底物來命名（絕大多數(shù)酶）：蛋白酶、淀粉酶；2.依據(jù)催化反應的性質命名：水解酶、轉氨酶；3結合上述兩個原則命名：琥珀酸脫氫酶；4.有時加上酶的來源：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。（二）國際系統(tǒng)命名基本原則：明確標明酶的底物及催化反應的性質（底物為水時可略去不寫）。舉例：

谷丙轉氨酶的系統(tǒng)名稱：丙氨酸:-酮戊二酸氨基轉移酶

丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉移酶乙醇脫氫酶EC1.1.1.1，乳酸脫氫酶EC1.1.1.27，蘋果酸脫氫酶EC1.1.1.37第一個數(shù)字表示大類：氧化還原酶類第二個數(shù)字表示反應基團：醇基第三個數(shù)字表示電子受體：NAD+或NADP+第四個數(shù)字表示此酶底物：乙醇，乳酸，蘋果酸。前面三個編號表明這個酶的特性：反應性質、底物性質（鍵的類型）及電子或基團的受體，第四個編號用于區(qū)分不同的底物?！锩傅膰H系統(tǒng)分類★1、2、3、4、5、6分別表示：氧、轉、水、裂、異、合氧化-還原酶催化氧化-還原反應。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸脫氫酶；乳酸：NAD+氧化還原酶（EC1.1.1.27）

催化乳酸的脫氫反應。(1)氧化-還原酶Oxido－reductase水解酶催化底物的水解反應。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的酯的水解反應：(3)水解酶hydrolase裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應及其逆反應。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），習慣名：醛縮酶。(4)裂合酶Lyase（一）酶專一性類型1、結構專一性（1）絕對專一性酶對底物的要求非常嚴格，只能對某一種底物的某一種反應起催化作用。

脲酶只能催化尿素水解,而對尿素的各種衍生物或尿素的其它反應不起作用。麥芽糖酶只作用于麥芽糖。（2）相對專一性：對底物專一性降低，可作用一類結構相似的底物。

四、酶的專一性★基團專一性除了對鍵有要求，還對于鍵的一端的基團要求嚴格。例如：1.α-D-葡萄糖苷酶不但要求α-糖苷鍵,并且要求α-糖苷鍵的一端必須有葡萄糖殘基,而對鍵的另一端基團則要求不嚴,因此它可催化含有α-葡萄糖苷的蔗糖或麥芽糖水解,但不能使含有β-葡萄糖苷的纖維二糖水解。2.

胰蛋白酶水解含有賴氨酰-或精氨酰-羰基肽鍵的物質?！镦I專一性：作用于具有相同化學鍵的一類底物,對鍵兩端的基團并無嚴格要求。這類酶對底物結構的要求低。例如：酯酶可催化所有含酯鍵的酯類物質水解。

2.立體異構專一性

有些酶不僅對底物化學結構有要求,而且對底物分子的立體構型也有要求,稱作立體異構專一性。立體異構專一性又分兩類:(1)旋光異構專一性當?shù)孜锞哂行庑詴r,酶只能作用于其中的一種。它是酶反應中相當普遍的現(xiàn)象。例如：

L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化,而對D-氨基酸無作用。(2)幾何（順反）異構專一性

酶對底物的幾何構型有嚴格的要求稱之為幾何異構專一性。

例如：延胡索酸酶只能催化反丁烯二酸（即延胡索酸），而不能催化順丁烯二酸的水合作用。（二）

酶作用專一性的解釋1、鎖鑰模型(lock-keyhypothesis)

Fisher1894；酶活性中心的形狀與底物分子形狀互補。底物分子或其一部分像鑰匙一樣，專一地插入酶活性中心，通過多個結合位點的結合，形成酶—底物復合物。酶活性中心的催化基團正好對準底物的有關敏感鍵，進行催化反應。鎖鑰模型較好地解釋了立體異構專一性。但不能解釋可逆反應。2、誘導契合模型(induced-fithypothesis)（Koshland1958年提出），酶分子與底物分子接近時，酶蛋白質受底物分子誘導，構象發(fā)生有利于與底物結合的變化，酶與底物在此基礎上互補契合，進行反應。總之：酶與底物作用的專一性是酶與底物分子的結構互補，誘導契合，通過分子的相互識別而產(chǎn)生的。五、酶的活力測定（一）酶活力與酶促反應速度酶活力（enzymeactivity）：酶催化某一反應的能力，其大小可用在一定條件下，酶催化某一反應的反應速度表示（一般測初速度）。酶促反應速度：單位時間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量；單位：濃度/單位時間研究酶促反應速度，以酶促反應的初速度為準(底物消耗≤5%）。因為底物濃度降低、酶部分失活、產(chǎn)物抑制和逆反應等因素，會使反應速度隨反應時間的延長而下降。（二）酶的活力單位：表示酶活力大小所用的單位國際單位（IU單位）：在最適反應條件下，每分鐘催化1μmol底物轉化為產(chǎn)物所需的酶量，稱一個國際單位（IU），1IU=1μmol/min。國際單位（Katal,Kat單位）：在最適反應條件下，每秒鐘催化1mol底物轉化為產(chǎn)物所需的酶量，稱Kat單位1Kat＝60×106IU；1IU＝1/60μKat＝16.7nKat最適條件：最適溫度,最適pH、最適緩沖液離子強度、最適底物濃度。底物濃度要求：（1）通常很大，使酶飽和；（2）底物消耗≤5%。（三）酶活力的測定酶活力的測定包括兩個階段：首先在一定條件下，酶與底物反應一段時間，然后再測定反應液中底物或產(chǎn)物的變化量。六、酶分子工程

固定化酶是指將水溶性的酶用物理或化學方法處理，使之成為不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反應后的酶可以回收重復使用。（一）固定化酶什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術固定化酶的優(yōu)點①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開;②可以在較長時間內(nèi)進行反復分批反應和裝柱連續(xù)反應;③在大多數(shù)情況下,能夠提高酶的穩(wěn)定性;④酶反應過程能夠加以嚴格控制;⑤產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留,簡化了提純工藝;⑥可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質量;⑦酶的使用效率提高,成本降低。（二）酶的化學修飾（Chemicalmodification）

是指用化學手段將某些原子或化學基團結合到酶分子上，或將酶分子中某基團改變，從而達到改變酶的催化性質及一些生理生化性質的目的。酶的化學修飾廣泛用于酶的作用機理研究，醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、酶工程、生化工程等領域?；瘜W修飾具有易實現(xiàn)，作用快，成本低等優(yōu)點，是一項常用的重要技術。例如：1、用乙醛酸修飾胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成親水性的α－NHCH2COOH后，該酶對60°C熱處理的穩(wěn)定性增高了1000倍。2、超氧化物歧化酶、尿酸酶等用PEG修飾后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們在動物血液循環(huán)中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。（三）抗體酶(Abzyme)又稱催化性抗體（catalyticantibody）。是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結合的產(chǎn)物，本質上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。

抗體酶的制備方法

誘導法

以Pauling的穩(wěn)定過渡態(tài)理論為指導，即酶的催化在于能結合底物產(chǎn)生過渡態(tài)，降低能障（反應的活化能）。以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導與其互補構象的抗體，使其具有催化活性，可觀察到抗體催化相應底物發(fā)生化學反應。

用設計好的半抗原，通過間隔鏈與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對動物進行免疫，取免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞雜交，雜交細胞分泌單克隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得到抗體酶。例：Schultz研究小組以羧酸二酯水解反應的過渡態(tài)類似物對硝基苯磷酰膽堿作為半抗原，誘導產(chǎn)生單