蛋白質(zhì)的分離純化-2課件

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化第一節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第二節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定第四節(jié)蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定第一節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)和沉淀二、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液能吸收一定波長(zhǎng)的紫外光，主要是由帶芳香環(huán)的氨基酸決定的。其在280nm處對(duì)紫外吸收能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋荷═rp）>酪（Tyr）>苯丙（Phe）三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)和沉淀蛋白質(zhì)的分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍。蛋白質(zhì)溶液是一種穩(wěn)定的親水膠體（具有水化層和雙電子層）。蛋白質(zhì)溶液具有膠體的一般性質(zhì)：布朗運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾效應(yīng)以及不能通過(guò)半透膜。半透膜：多是由用賽咯吩（cellophane）制造，賽咯吩膜是半通透的膜，蛋白質(zhì)等大分子不能透過(guò)膜，但小分子可以透過(guò)。（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。如果條件發(fā)生改變,破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性與質(zhì)點(diǎn)大小、電荷和水化作用有關(guān),那么任何影響這些條件的因素都會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

沉淀蛋白質(zhì)的方法有以下幾種:中性鹽沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法、生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法、加熱變性沉淀法.2.有機(jī)溶劑沉淀法向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機(jī)溶劑(如甲醇,乙醇或丙酮等)引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。3.重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液pH大于等電點(diǎn)（pI）時(shí),蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，這樣它就容易與重金屬離子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。應(yīng)用：誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進(jìn)行解救,然后再服用催吐劑排出體外。4.生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類(lèi)試劑：如：鞣酸（單寧酸,tannicacid)鎢酸(tungsticacid，H2WO4)、苦味酸(picricacid)即2,4,6-三硝基酚,碘化鉀等。某些酸類(lèi):三氯醋酸,磺基水楊酸（sulfosalicylicacid）和硝酸等.

當(dāng)pH<pI，蛋白質(zhì)帶正電荷與生物堿試劑某些酸根負(fù)離子

不溶性沉淀反應(yīng)四、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)變性的定義：

環(huán)境的變化或是化學(xué)處理都會(huì)引起蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的破壞，并伴隨著生物活性的喪失、溶解度的降低以及其它理化常數(shù)的改變，這一過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的復(fù)性：蛋白質(zhì)的復(fù)性當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又重新回復(fù)到天然構(gòu)象的現(xiàn)象成為蛋白質(zhì)的復(fù)性。蛋白質(zhì)變性后的特性：

生物活性喪失、側(cè)鏈基團(tuán)暴露、理化性質(zhì)改變、生化性質(zhì)改變五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)反應(yīng)名稱(chēng)試劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個(gè)以上肽鍵

酚試劑反應(yīng)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基第二節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化二、蛋白質(zhì)的分離純化方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)不同對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分子大小溶解度電荷吸附性質(zhì)對(duì)配體分子的生物學(xué)親和力（一）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法主要方法：1：透析（dialysis）和超過(guò)濾（ultrafiltration）2：密度梯度（區(qū)帶）離心3：凝膠過(guò)濾法1：透析和超過(guò)濾（利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)）超過(guò)濾裝置

使用壓力或者離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜（半透膜），達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。裝好具備密度梯度的介質(zhì)溶液離心收集分離后的各組分加入：混和蛋白質(zhì)樣品離心裝置2：密度梯度（區(qū)帶）離心3：凝膠過(guò)濾法

凝膠過(guò)濾是按照蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱(chēng)凝膠層析、分子篩層析或排阻層析。凝膠過(guò)濾法是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。凝膠過(guò)濾分離蛋白質(zhì)的流程開(kāi)始洗脫后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脫出來(lái)洗脫收集上樣樣品上柱后，樣品中的小分子可以進(jìn)入凝膠微孔，但是大分子不能進(jìn)入。這樣大小不同的蛋白質(zhì)就被分離開(kāi)來(lái)了。依次洗脫收集后，通過(guò)紫外吸收法測(cè)定吸收峰。2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析鹽溶（salting-in）

：低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的鹽溶現(xiàn)象。同濃度二價(jià)中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響比單價(jià)中性鹽大的多。鹽析（salting-out）

：當(dāng)溶液中的離子強(qiáng)度達(dá)到一定的數(shù)值時(shí)（鹽濃度高達(dá)一定數(shù)值時(shí)），蛋白質(zhì)的溶解度開(kāi)始下降，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析。3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法與水互溶的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低，在室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。這種沉淀的主要原因是有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。4.改變溫度分離蛋白質(zhì)0~40oC之間：大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，

例外：0～25oC，人的血紅蛋白溶解度隨溫度上升而降低。40~50oC以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開(kāi)始變性。一般蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在0~4oC溫度下進(jìn)行。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的純化方法主要方法：

電泳離子交換層析電泳概述由于蛋白質(zhì)在指定的PH溶液中所帶電荷和分子量不同，形狀不同，在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同。因此根據(jù)這一原理就可以從蛋白質(zhì)混合液中將各種蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，所以電泳技術(shù)已成為分析、分離蛋白質(zhì)的重要手段之一。1.聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamindegelelectrophoresis)PAGE電泳它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板（不連續(xù)體系）。凝膠的濃度（孔徑大?。?、緩沖液組分和離子強(qiáng)度、pH以及電場(chǎng)強(qiáng)度都是不同的濃縮膠分離膠樣品濃縮成很薄的起始區(qū)帶（0.1mm）分離成單區(qū)帶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)

SDS:是用SDS（十二烷基硫酸鈉）和還原劑（通常為巰基乙醇）先對(duì)待分離的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)處理（加熱煮沸3－5分鐘）。通過(guò)加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性：多亞基的蛋白質(zhì)解離為單亞基。二硫鍵被切斷。

SDS是帶有負(fù)電荷的分子，所有結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)的形狀近似于長(zhǎng)的橢圓棒，全部帶上了大量的負(fù)電荷。電泳時(shí)SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響（全部由負(fù)極向正極移動(dòng)），而主要取決于蛋白質(zhì)分子量。濃縮膠分離膠樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置點(diǎn)樣濃縮膠分離膠樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置2.毛細(xì)管電泳①泛指高效毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、自由溶液毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電泳。②用途：分離多種生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多種小分子，如藥物、甚至金屬離子。用樣量5～30μl1mg/ml溶液。3.等電聚焦電泳等電聚焦或稱(chēng)電聚焦，是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，它也可用于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定。蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)（如濃蔗糖溶液）中進(jìn)行電泳的。在外電場(chǎng)作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，并形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。等電聚焦可以把人的血清分成40多個(gè)條帶。此技術(shù)特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02（甚至<0.02）pH單位的差別就能分開(kāi)。實(shí)際上是利用緩沖液在電場(chǎng)作用下在凝膠內(nèi)沿電場(chǎng)方向制造一個(gè)pH梯度。所用的緩沖液是低分子量的有機(jī)酸和堿的混合物，該混合物稱(chēng)之兩性電解質(zhì)。等電聚焦電泳裝置當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時(shí)，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI

相一致的pH處，具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處，達(dá)到分離的目的。4.蛋白質(zhì)的雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis）

將等電聚焦電泳與SDS結(jié)合起來(lái)的電泳技術(shù)。電泳方向電泳方向等電聚焦電泳SDS雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差異分離蛋白質(zhì)混合物的柱層析方法。特種多緩沖交換劑PH降低混和蛋白質(zhì)樣品特種多緩沖液特種多緩沖液收集特種多緩沖液收集特種多緩沖液依次收集不同的蛋白組分5.層析聚焦(P310)填充到層析柱中的樹(shù)脂有陽(yáng)離子交換型和陰離子交換型。支持介質(zhì)：

對(duì)蛋白質(zhì)交換容量大陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑CM—纖維素(弱酸型)P纖維素(中強(qiáng)酸型)SE纖維素(強(qiáng)酸型)SPSephadex(強(qiáng)酸型)AM—纖維素(弱堿型)PAB--纖維素(弱堿型)DEAE-纖維素(中強(qiáng)堿型)DEAE-Sephadex(中強(qiáng)堿型)TEAE-纖維素(強(qiáng)堿型)QAESephadex(強(qiáng)堿型)6.離子交換層析(P310)以陽(yáng)離子交換型樹(shù)脂為例將帶有耐酸性非常強(qiáng)的磺酸根SO3-Na＋（以鹽的形式出現(xiàn)）的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（固定相）填充到層析柱中。將含有樣品的流動(dòng)相加入層析柱中，樣品中帶有正電荷的蛋白質(zhì)X，通過(guò)靜電吸引，與樹(shù)脂中的帶電基團(tuán)相互作用，結(jié)果X與Na＋交換（陽(yáng)離子交換），形成SO3-X，蛋白質(zhì)就結(jié)合到了層析柱上。在樣品與樹(shù)脂充分交換后，可通過(guò)提高流動(dòng)相中的鹽濃度，或改變流動(dòng)相的pH，或是同時(shí)采用這兩種方法，就可以將結(jié)合于樹(shù)脂上的蛋白質(zhì)X成分，按照它們與樹(shù)脂結(jié)合的強(qiáng)弱程度不同逐一地洗脫下來(lái)。結(jié)合到層析柱上的蛋白質(zhì)的洗脫有不同的洗脫方式：洗脫方式恒定濃度洗脫改變鹽濃度或pH洗脫跳躍式分段洗脫漸進(jìn)式連續(xù)改變(梯度洗脫)簡(jiǎn)單型混合器復(fù)合型混合器利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離目的。

典型的吸附劑：硅膠,氧化鋁和活性炭等.

主要用來(lái)分離非離子、水不溶性化合物（四）利用選擇性吸附的純化方法(P312)

親和層析(affinitychromatography)：是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力,即生物學(xué)親和力，建立起來(lái)的一種有效的純化方法。經(jīng)常只需一步處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復(fù)雜混合物中分離出來(lái)，純度相當(dāng)高。(五)利用與配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法(P313)親和層析

把某一待純化蛋白質(zhì)的特異配體通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到像瓊脂糖凝膠這一類(lèi)的載體表面。

向含有載體的層析柱中加入樣品，樣品中待純化的蛋白質(zhì)由于與載體上的配體結(jié)合而被吸附，而其它蛋白質(zhì)和雜質(zhì)成分通過(guò)平衡液的洗滌可以被除去。

被特異結(jié)合的蛋白質(zhì)可用含游離的相應(yīng)配體溶液（高濃度洗脫液）洗脫(親合洗脫)并進(jìn)行收集。樣品層析柱凝膠上的配體樣品中待分離的的蛋白成分蛋白與凝膠上的配體特異結(jié)合在凝膠球上，其余未結(jié)合的樣品成分被平衡液洗脫下來(lái)。樣品凝膠上的配體樣品中能與配體特異結(jié)合的蛋白成分高濃度的蛋白配體或者是類(lèi)似物高濃度的蛋白配體或者是類(lèi)似物蛋白質(zhì)的分離純化方法分子大?。喝芙舛龋弘姾桑何叫再|(zhì)：對(duì)配體分子的親和力：透析和超過(guò)濾、密度梯度（區(qū)帶）離心、凝膠過(guò)濾法等電點(diǎn)和PH值控制、鹽溶鹽析、有機(jī)溶劑分級(jí)分離、變溫度電泳、離子交換層析親和層析第三節(jié)蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定(P291-299)一、根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量

用化學(xué)分析方法測(cè)定出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量,可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低相對(duì)分子質(zhì)量。如Fe，并假設(shè)每個(gè)蛋白質(zhì)分子中只有1個(gè)Fe原子，則由此可算出蛋白質(zhì)的最低相對(duì)分子質(zhì)量。例如:某種蛋白含鐵量為0.335%,其最低相對(duì)分子質(zhì)量(假設(shè)此蛋白只含有一個(gè)鐵原子如肌紅蛋白)可按下式計(jì)算出:若此蛋白含4個(gè)鐵原子（如血紅蛋白），則：Mr=16700×4＝86600最低相對(duì)分子質(zhì)量Mr鐵的原子質(zhì)量鐵的百分含量=55.80.335×100=×100=16700即某蛋白的真實(shí)

Mr=16700×n（n為含有的鐵原子的數(shù)目）滲透現(xiàn)象：溶劑分子由純?nèi)軇ɑ蛳∪芤海┫蛉芤海ɑ驖馊芤海﹩畏较虻膬粢苿?dòng)現(xiàn)象。二、根據(jù)滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量半透膜溶劑蛋白質(zhì)溶液滲透壓h滲透壓測(cè)定的裝置小分子可以通過(guò)，但蛋白質(zhì)等大分子不能通過(guò)。Mr=

RTlim(/c)c0R:氣體常數(shù)；T：絕對(duì)溫度；：滲透壓；c:溶質(zhì)的濃度。注意事項(xiàng)：盡量采用等電點(diǎn)或者接近等電點(diǎn)的緩沖溶液做為半透膜內(nèi)外的溶劑，以避免PH值對(duì)滲透壓的影響。滲透壓法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：裝置簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度相對(duì)高。缺點(diǎn)：不能區(qū)別所測(cè)蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)樣品是否均一。如果溶液含多種蛋白質(zhì)成分，那么測(cè)出的是幾種蛋白質(zhì)的平均分子量。（三）蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散（平移擴(kuò)散）：由于濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移。擴(kuò)散系數(shù)D：在數(shù)值上等于當(dāng)濃度梯度為一個(gè)單位時(shí)，在一秒鐘內(nèi)通過(guò)1cm2面積所擴(kuò)散的溶質(zhì)量。擴(kuò)散系數(shù)D的特點(diǎn)：(2)擴(kuò)散系數(shù)一般不單獨(dú)用來(lái)決定Mr,但如后面所說(shuō)的與沉降系數(shù)結(jié)合起來(lái),可以給出蛋白質(zhì)的精確相對(duì)分子質(zhì)量。(1)隨Mr的增加而降低,但擴(kuò)散系數(shù)對(duì)Mr的變化并不敏感。

（四）沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量需轉(zhuǎn)速為60,000～80,000rpm的超速離心機(jī)

測(cè)Mr常用兩種方法：沉降速度法沉降平衡法沉降：蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心力作用時(shí)，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度，蛋白質(zhì)分子就會(huì)發(fā)生沉降，沉降的速度與蛋白質(zhì)的分子大小、形狀、密度以及溶液的性質(zhì)有關(guān)。1.沉降速度法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量沉降系數(shù)(s):單位離心場(chǎng)的沉降速度。液面界面溶劑坪區(qū)池底界面移動(dòng)的速度即沉降速度，溶質(zhì)的相對(duì)分子量越大，則界面移動(dòng)越快，若溶液中有幾種溶質(zhì)，則離心之后就會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)界面。界面移動(dòng)的速度可以借助適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)來(lái)觀察。如人血紅蛋白沉降系數(shù)s=4.46S，即4.46×10－13秒。為了比較起見(jiàn)，在不同溫度和溶劑中測(cè)得的沉降系數(shù)需要換算成標(biāo)準(zhǔn)條件下的s值。沉降系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)條件定為20C,溶劑為水。校正后的沉降系數(shù)用s20，w表示。

大部分生物大分子的沉降系數(shù)介于1×10-13到200×10-13秒的范圍。因此：把10-13秒作為一個(gè)單位，稱(chēng)為斯維得貝格單位或稱(chēng)沉降系數(shù)單位，用S(大寫(xiě))來(lái)表示。

即：1S＝10-13秒Mr=RTsD（1－Vρ）R:氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T:絕對(duì)溫度D

:擴(kuò)散常數(shù)（可用試驗(yàn)求得）V

:蛋白質(zhì)的偏微比容（m3·g-1）ρ:溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s

:沉降系數(shù)（可以根據(jù)沉降速度和離心力求得）蛋白質(zhì)分子量與沉降系數(shù)的關(guān)系2.沉降平衡法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量利用較低轉(zhuǎn)速（8000~20000r/min）進(jìn)行。由于分子顆粒沉降造成濃度梯度，因而產(chǎn)生了擴(kuò)散作用。x2x1離心力離心池軸心液面擴(kuò)散力蛋白質(zhì)的沉降平衡

2RTdln(c2/c1)(1-)2(x22-x12)Mr=R:氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T:絕對(duì)溫度V

:蛋白質(zhì)的偏微比容（m3·g-1）ρ:溶劑密度（20℃，g·ml-1）:轉(zhuǎn)子的角速度。c1、c2:距離旋轉(zhuǎn)中心x1和x2處的蛋白質(zhì)濃度。x2x1離心力軸心液面擴(kuò)散力利用凝膠過(guò)濾可以把蛋白質(zhì)混合物按分子的大小分離開(kāi)來(lái)（五）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量洗脫過(guò)程凝膠球如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體具有相同的過(guò)柱速度即相同的洗脫體積（elutionvolume）,則認(rèn)為這種蛋白質(zhì)具有與此球體相同的半徑,稱(chēng)蛋白質(zhì)分子的斯托克半徑。因此,標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(已知Mr和斯托克半徑)和待測(cè)蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀(接近球體),否則不能得到比較準(zhǔn)確的Mr。注意：分子形狀為線形的或與凝膠能發(fā)生吸附作用的蛋白質(zhì),則不能用此方法測(cè)定Mr。Gelfiltrationcolumn1966年Andrews提出了一個(gè)經(jīng)驗(yàn)公式VeVo=

a-blgMr其中：Ve為洗脫體積；Vo為外水體積

Mr為相對(duì)分子質(zhì)量；a和b為常數(shù)①方法簡(jiǎn)便，儀器簡(jiǎn)單。②不純樣品亦可，只要找出活性峰位置（Ve）即可。lgMrVea

1VebbVo

lgMr=_做直線圖(六)SDS－PAGE法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量

SDS處理蛋白質(zhì)之后，所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有了大量的負(fù)電荷，而且分子都呈現(xiàn)統(tǒng)一的長(zhǎng)橢圓形。

SDS電泳時(shí)SDS-蛋白質(zhì)