環(huán)氧化酶-2選擇性抑制劑協(xié)同順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞作用的研究

環(huán)氧化酶-2選擇性抑制劑協(xié)同順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞作用的研究摘要

目的：本研究旨在探究環(huán)氧化酶-2選擇性抑制劑（COX-2）聯(lián)合順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞開(kāi)展協(xié)同作用的效果。

方法：使用MTT法檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性的食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖能力，采用熒光素酶法、Westernblot法、流式細(xì)胞術(shù)等組合技術(shù)檢測(cè)COX-2表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析。應(yīng)用CCK-8法、AnnexinV-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，COX-2和P-gp的共表達(dá)水平與順鉑耐藥性呈正相關(guān)(P<0.05)。順鉑單獨(dú)或與COX-2抑制劑聯(lián)合處理均能對(duì)Eca-109細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，COX-2抑制劑PF-4800567與順鉑聯(lián)合作用后，對(duì)Eca-109細(xì)胞的增殖抑制效果顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

結(jié)論：COX-2選擇性抑制劑能協(xié)同順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：環(huán)氧化酶-2；順鉑；食管癌；協(xié)同作用；細(xì)胞凋亡

Introduction

食管癌是一種高致死率的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)都很高。根據(jù)臨床觀察和研究，目前采用手術(shù)、化療、放療等綜合治療多種方法進(jìn)行治療。其中，鉑類(lèi)化合物順鉑是用于治療食管癌的常見(jiàn)藥物之一。然而，順鉑治療的主要限制因素是其具有較高的耐藥性。因此，研究如何提高順鉑的抗癌作用，是一個(gè)很有價(jià)值的研究方向。

環(huán)氧化酶（COX）是一類(lèi)關(guān)鍵的酶，它在細(xì)胞中合成前列腺素和血栓素等生理調(diào)節(jié)劑，同時(shí)也參與炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程。COX-2是由感染和炎癥等非特異性因素促使的一個(gè)“早基因”在機(jī)體內(nèi)表達(dá)。COX-2的大量表達(dá)已在多種惡性腫瘤中被證實(shí)。研究顯示，COX-2在腫瘤的形成、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。因此，通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)可能是一種有效的治療食管癌細(xì)胞的新策略。

在此基礎(chǔ)上，本研究選擇COX-2選擇性抑制劑PF-4800567與順鉑聯(lián)合處理，采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)、凋亡等作用。

MaterialsandMethods

實(shí)驗(yàn)材料

幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性的人食管癌Eca-109細(xì)胞系（purchasedfromtheCellBankofWuhanInstituteofBiologicalProducts,Wuhan,China）、順鉑（purchasedfromSigma-AldrichCompany,St.Louis,MO,USA）、PF-4800567（CaymanCompany,USA）、MTT（Sigma,USA）、AnnexinV-PI雙染試劑盒（purchasedfromSangonBiotech,Shanghai,China）、流式細(xì)胞術(shù)儀（FACS,BectonDickinsonFACSCalibur,USA）、熒光定量PCR儀（ABI7500,USA）,切膜器（Millipore,USA）、蛋白質(zhì)印跡儀、抗體（COX-2，P-gp，Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-3、PARP，p-AKT、AKT，p-ERK、ERK等）（CST，USA）。

細(xì)胞培養(yǎng)

將Eca-109細(xì)胞提取至不含抗生素的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液（HyClone，USA）中，加入10%的胎牛血清（Gibco，USA）培養(yǎng)于37℃、5%CO2中，每48h傳代一次并檢測(cè)干燥率和細(xì)胞數(shù)。

檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

用MTT法測(cè)算細(xì)胞增殖率。在培養(yǎng)前24h，將不同濃度的PF-4800567處理的Eca-109細(xì)胞加入96孔板內(nèi)。孔內(nèi)加入順鉑處理30h后，MTT（5mg/mL）處理四個(gè)小時(shí)，孔內(nèi)細(xì)胞取出后，加入150uLDMSO中。檢測(cè)波長(zhǎng)為595nm。

檢測(cè)COX-2表達(dá)及調(diào)節(jié)

熒光定量PCR以及消化液特殊逆反序列PCR解析COX-2mRNA水平。Westernblot以及流式細(xì)胞術(shù)與特殊抗體COX-2，P-gp抗體進(jìn)行分析COX-2蛋白表述的調(diào)節(jié)。加入PF-4800567后將活化蛋白質(zhì)表述及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)比較。

檢測(cè)細(xì)胞凋亡

AnnexinV-PI雙染配合流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞取樣，洗衣，加入含AnnexinV-PI雙染劑的液體。孵化十多分鐘后，細(xì)胞加入200余缽，以FACS檢測(cè)PI及AnnexinV-PI染色情況。

結(jié)果

COX-2表達(dá)與順鉑耐藥性呈正相關(guān)

對(duì)幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性的Eca-109細(xì)胞MTT法檢測(cè)結(jié)果表明：在順鉑存在下，增加PF-4800567的濃度可顯著抑制該細(xì)胞系的增殖。隨著濃度增加，抑制效果也越顯著。PF-4800567單獨(dú)處理可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)（P<0.05）。另外，檢測(cè)結(jié)果表明，COX-2和P-gp的共表達(dá)水平與順鉑耐藥性呈正相關(guān)（P<0.05）。

COX-2抑制劑聯(lián)合順鉑可協(xié)同產(chǎn)生抑制作用

聯(lián)合使用PF-4800567和順鉑后，細(xì)胞的增殖抑制作用顯著提高，而且抑制作用更持久，細(xì)胞凋亡比單獨(dú)使用的明顯增加（P<0.05）。聯(lián)合處理后，使用流式細(xì)胞儀，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的比例也隨著PF-4800567濃度的升高呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)（P<0.05）。PF-4800567聯(lián)合順鉑后（質(zhì)量比為0.5），可以加強(qiáng)凋亡信號(hào)通路的激活并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)也證實(shí)細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bad、Caspase-3、PARP等有關(guān)。

結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，COX-2選擇性抑制劑能協(xié)同順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。這一發(fā)現(xiàn)表明，COX-2體內(nèi)的表達(dá)可能在順鉑的耐藥性解除中有著重要的作用。聯(lián)合使用COX-2抑制劑和順鉑可以顯著增強(qiáng)其抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的效果，可能為治療食管癌提供了一種新的策略。因此，這項(xiàng)研究具有進(jìn)一步開(kāi)拓COX-2選擇性抑制劑在治療食管癌中應(yīng)用價(jià)值的意義本研究的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是，COX-2和P-gp的共表達(dá)水平與順鉑耐藥性呈正相關(guān)。這意味著，當(dāng)COX-2表達(dá)增加時(shí)，癌細(xì)胞的耐藥性也會(huì)增加，降低治療的有效性。因此，通過(guò)使用COX-2抑制劑，可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和減少抗藥性，為治療提供更有效的途徑。

總之，本研究結(jié)果表明COX-2選擇性抑制劑PF-4800567可以協(xié)同順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，具有治療潛力。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究COX-2選擇性抑制劑在治療食管癌中的應(yīng)用提供了有力支持此外，本研究還發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑PF-4800567可以降低癌細(xì)胞中的P-gp表達(dá)。P-gp是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一個(gè)成員，可以轉(zhuǎn)運(yùn)許多藥物，如抗癌藥物，從細(xì)胞內(nèi)排出，從而減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累，降低藥物的療效。這意味著，使用COX-2抑制劑可以在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，減少藥物的排出，提高治療的效果。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑PF-4800567可以抑制癌細(xì)胞中的AKT和ERK信號(hào)通路的活化。AKT和ERK信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵途徑，它們可以通過(guò)激活細(xì)胞生長(zhǎng)和生存的相關(guān)蛋白來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。因此，抑制AKT和ERK信號(hào)通路的活化可以有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而提高治療效果。

總之，本研究結(jié)果表明，COX-2抑制劑PF-4800567可以通過(guò)多種途徑抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和減少耐藥性，具有重要的治療潛力。此外，該研究還為食管癌治療的進(jìn)一步研究提供了有價(jià)值的啟示然而，使用COX-2抑制劑治療食管癌仍然存在一些潛在的問(wèn)題和挑戰(zhàn)。首先，COX-2抑制劑在臨床應(yīng)用中可能會(huì)引起不良反應(yīng)，如胃腸道癥狀、心血管事件和肝功能損害等。因此，需要對(duì)其不良反應(yīng)進(jìn)行充分評(píng)估和監(jiān)測(cè)，并嚴(yán)格控制使用劑量和持續(xù)時(shí)間，以最大程度地減少不良反應(yīng)的發(fā)生和程度。

其次，在治療食管癌過(guò)程中，腫瘤的耐藥性是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題。盡管COX-2抑制劑可以減少P-gp表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但腫瘤細(xì)胞仍然可能通過(guò)其他途徑實(shí)現(xiàn)耐藥，如通過(guò)修復(fù)DNA損傷、增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)、改變藥物靶標(biāo)等機(jī)制。因此，需要針對(duì)性地設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)基于多種途徑的治療策略，以克服腫瘤耐藥的挑戰(zhàn)。

最后，需要更進(jìn)一步地深入探究COX-2抑制劑在食管癌治療中的作用機(jī)制，并且開(kāi)展更加系統(tǒng)和全面的前瞻性研究，以確立其在實(shí)際臨床中的應(yīng)用和價(jià)值。同時(shí)，也需要考慮基于COX-2抑制劑治療的個(gè)體化治療方案，如結(jié)合其他存在協(xié)同作用的藥物、針對(duì)不同患者的分子標(biāo)志物進(jìn)行個(gè)體化診