【課件】植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2章

細(xì)胞工程第1節(jié)

植物細(xì)胞工程一

植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)

細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科的原理和方法，通過細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。細(xì)胞工程原理和方法：操作的水平：目的：分類：細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科。細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品。植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程1902年，哈伯蘭特提出了細(xì)胞全能性的理論，但相關(guān)的實(shí)驗(yàn)嘗試沒有成功。1958年，斯圖爾德等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可以分化為胚，為細(xì)胞全能性理論提供了強(qiáng)有力的支持。1960年，科金用真菌的纖維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。1964年，古哈等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時(shí)，首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的胚。1971年，卡爾森誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得了第一株體細(xì)胞種間雜種植株。1974年，土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)，之后，該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，促進(jìn)了植物細(xì)胞工程與分子生物學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合。細(xì)胞的全能性1.概念：細(xì)胞經(jīng)過分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化為其他各種細(xì)胞的潛能韌皮部細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)根或芽幼苗胡蘿卜植株脫分化再分化2.具有全能性的原因：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)3.不同細(xì)胞全能性的大小：分化程度低的＞分化程度高的細(xì)胞分裂能力強(qiáng)的＞細(xì)胞分裂能力弱的①體細(xì)胞全能性：②不同細(xì)胞的全能性：受精卵＞胚胎干細(xì)胞＞生殖細(xì)胞＞體細(xì)胞③不同生物的細(xì)胞全能性：植物細(xì)胞＞動(dòng)物細(xì)胞4.體現(xiàn)全能性的要點(diǎn)：起點(diǎn)：經(jīng)分裂和分化后的細(xì)胞終點(diǎn)：完整個(gè)體或其他各種細(xì)胞5.不體現(xiàn)全能性的實(shí)例：芽原基只能發(fā)育為芽，葉原基只能發(fā)育為葉葉原基芽原基原因：在特定的時(shí)間和空間條件下，細(xì)胞中的基因會(huì)選擇性表達(dá)①利用菊花莖段培養(yǎng)獲得試管苗；②利用胡蘿卜的韌皮部細(xì)胞培養(yǎng)獲得胡蘿卜幼苗；③受精卵發(fā)育成個(gè)體；④通過花藥離體培養(yǎng)，獲得單倍體幼苗。⑤蜜蜂的孤雌生殖中，卵細(xì)胞直接發(fā)育成雄蜂；⑥胚胎干細(xì)胞可分化發(fā)育成為各種組織器官的細(xì)胞6.植物細(xì)胞表達(dá)出全能性的條件：離體一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素適宜的環(huán)境條件（溫度，PH，無菌）思考：1.是不是所有的活細(xì)胞都具有全能性？2.種子發(fā)育成植株體現(xiàn)了全能性了嗎？3.細(xì)胞具有的全能性一定能表現(xiàn)出來嗎？不是；例如哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞、植物成熟的篩管細(xì)胞。沒有；植物種子種的胚已完成了早期發(fā)育，相當(dāng)于新植物體的幼體，沒有體現(xiàn)出細(xì)胞具有發(fā)育成完整植株的潛能。不一定；例如動(dòng)物的體細(xì)胞。植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)是指離體的植物器官，組織和細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。離體人工配制的培養(yǎng)基，適宜的培養(yǎng)條件植物組織培養(yǎng)前提：條件：結(jié)果：誘導(dǎo)其形成完整植株離體培養(yǎng)的植物器官，組織或細(xì)胞被稱為外植體體細(xì)胞個(gè)體無性生殖生殖細(xì)胞個(gè)體有性生殖植物組織培養(yǎng)技術(shù)

菊花的組織培養(yǎng)1.理論依據(jù)：植物細(xì)胞的全能性2.培養(yǎng)過程：接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織一定的激素，營(yíng)養(yǎng)脫分化脫分化已經(jīng)分化的細(xì)胞，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能，轉(zhuǎn)變成未分化的細(xì)胞愈傷組織不定形的薄壁組織團(tuán)塊（具有分裂和分化能力）1.脫分化過程中細(xì)胞的活動(dòng)：細(xì)胞分裂（有絲分裂）2.脫分化過程中一般不需要光照3.愈傷組織的代謝類型：異養(yǎng)需氧型

思考：若培養(yǎng)物取自植物的幼莖、葉片等含有葉綠體的部位，愈傷組織中是否會(huì)含有葉綠體？為什么？

愈傷組織中不含有葉綠體；

培養(yǎng)物經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化細(xì)胞，因此，愈傷組織中不含有葉綠體。接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根再分化愈傷組織重新分化成芽，根等器官1.再分化過程中細(xì)胞的活動(dòng)：細(xì)胞分裂，細(xì)胞分化2.再分化過程中需要光照（誘導(dǎo)葉綠素的合成）接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根脫分化再分化植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂，脫分化和再分化的關(guān)鍵激素生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值比值高促進(jìn)根分化，抑制芽形成比值低促進(jìn)芽分化，抑制根形成比值適中促進(jìn)愈傷組織形成口訣：生根，分芽，等愈傷3.材料用具：幼嫩的菊花莖段容易誘導(dǎo)形成愈傷組織培養(yǎng)基（P116MS培養(yǎng)基）包括無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（水和無機(jī)鹽）、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（蔗糖、氨基酸、維生素等）、特定濃度和比例的激素（主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素）；蔗糖的作用：提供能量，調(diào)節(jié)滲透壓4.方法步驟：（1）消毒①雙手和超凈工作臺(tái)臺(tái)面:用酒精擦拭②外植體:流水沖洗→酒精消毒30s→立即用無菌水清洗2～3次→次氯酸鈉溶液處理30min→立即用無菌水清洗2～3次。（2）外植體切段將消過毒的外植體置于無菌的培養(yǎng)皿中，用無菌濾紙吸去表面的水分。用解剖刀將外植體切成0.5～1cm長(zhǎng)的小段。

在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3～1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上作好標(biāo)記。（3）接種外植體注意：接種時(shí)注意外植體的方向，不要倒插！（4）脫分化

將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養(yǎng)瓶置于18～22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長(zhǎng)情況。注意：

該過程一般不需要光照，有光易形成維管組織，不易形成愈傷組織。（5）再分化

培養(yǎng)15～20d后，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基上→長(zhǎng)出芽后→將其轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上，進(jìn)一步誘導(dǎo)形成試管苗。注意：注意順序，先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根；該過程每日需要給予適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的光照?。?）移栽培養(yǎng)

移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)幾日。用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長(zhǎng)壯后再移栽入土。每天觀察并記錄幼苗的生長(zhǎng)情況，適時(shí)澆水、施肥，直至開花。5.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：（1）接種3～4d后，檢查外植體的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)有多少外植體被污染，有多少能正常生長(zhǎng)，試分析它們被污染的原因。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合某些微生物的生長(zhǎng)，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。導(dǎo)致外植體被污染的原因可能有：培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底；外植體消毒不徹底；操作過程不符合無菌操作要求等；（2）從剛接種的外植體到長(zhǎng)出愈傷組織需經(jīng)歷多少天？2周左右植物體細(xì)胞雜交技術(shù)1.概念番茄馬鈴薯利用傳統(tǒng)有性雜交方法能實(shí)現(xiàn)嗎？為什么？不能。因?yàn)閮煞N生物之間存在著天然的生殖隔離2.過程（1）去除細(xì)胞壁方法：利用纖維素酶和果膠酶去除這層細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶的酶溶液中一般加入一定濃度的無機(jī)鹽離子和甘露醇，試分析原因？使溶液具有一定的滲透壓，防止原生質(zhì)體吸水過多而漲破，保持原生質(zhì)體正常去壁去壁A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體去壁去壁A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合正在融合的原生質(zhì)體再生新壁再生出細(xì)胞壁（2）原生質(zhì)體間的融合（關(guān)鍵環(huán)節(jié)）誘導(dǎo)方法物理法：電融合法，離心法化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法完成融合標(biāo)志再生出細(xì)胞壁原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性思考：獲得的所有細(xì)胞一定是需要的雜交細(xì)胞嗎？不一定，有三類：①未融合的細(xì)胞②兩兩融合的細(xì)胞③多細(xì)胞融合體若只考慮兩兩融合AAABBB篩選ABAB去壁去壁A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合正在融合的原生質(zhì)體再生新壁再生出細(xì)胞壁（3）植物組織培養(yǎng)脫分化再分化移栽原理植物細(xì)胞的全能性過程脫分化，再分化植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志培育成新植物體去壁去壁融合再生新壁脫分化再分化移栽植物細(xì)胞融合技術(shù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)A細(xì)胞A原生質(zhì)體B細(xì)胞B原生質(zhì)體正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁愈傷組織雜種植株3.總結(jié)原理：生殖方式：分裂方式：可遺傳變異類型：植物細(xì)胞的全能性、細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性無性生殖。有絲分裂。染色體（數(shù)目）變異。AABBAABBAABB幾倍體？四倍體4.概念植物體細(xì)胞雜交是指將不同來源的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)。白菜—甘藍(lán)5.意義打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種。1.下圖是利用甲、乙兩種植物的各自優(yōu)勢(shì)，通過植物細(xì)胞工程技術(shù)培育高產(chǎn)、耐鹽的雜種植株的實(shí)驗(yàn)流程圖。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A.進(jìn)行a處理時(shí)能用胰蛋白酶B.b是誘導(dǎo)融合后得到的雜種細(xì)胞C.c是培養(yǎng)后得到的具有耐鹽性狀的幼芽D.進(jìn)行d選擇時(shí)要將植株種在高鹽環(huán)境中√2.科學(xué)家在制備原生質(zhì)體時(shí)，有時(shí)使用蝸牛消化道提取