細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染詳解

細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有20頁\編輯于星期日優(yōu)選細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染現(xiàn)在是2頁\一共有20頁\編輯于星期日現(xiàn)在是3頁\一共有20頁\編輯于星期日Sf-9細胞的形態(tài)現(xiàn)在是4頁\一共有20頁\編輯于星期日培養(yǎng)細胞生長的條件1、細胞的營養(yǎng)需要2、細胞的生存環(huán)境 溫度:28℃ 氧 滲透壓3、無污染4、無毒現(xiàn)在是5頁\一共有20頁\編輯于星期日實驗材料：實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸生化培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管現(xiàn)在是6頁\一共有20頁\編輯于星期日超凈臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

現(xiàn)在是7頁\一共有20頁\編輯于星期日生化培養(yǎng)箱生化培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為28℃。使用生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：1）保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。2）箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000ml蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)?，F(xiàn)在是8頁\一共有20頁\編輯于星期日培養(yǎng)瓶拿培養(yǎng)瓶的正確姿勢：拇指和食指夾住培養(yǎng)瓶，瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平，防止培養(yǎng)液倒向瓶口?，F(xiàn)在是9頁\一共有20頁\編輯于星期日血球計數(shù)板現(xiàn)在是10頁\一共有20頁\編輯于星期日細胞凍存和復蘇凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。現(xiàn)在是11頁\一共有20頁\編輯于星期日慢凍程序標準程序：當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中細胞凍存簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系 以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按 每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至 液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。現(xiàn)在是12頁\一共有20頁\編輯于星期日細胞復蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。現(xiàn)在是13頁\一共有20頁\編輯于星期日Sf9細胞的傳代判斷分離（散）細胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標就是觀察培養(yǎng)物是否已基本長滿培養(yǎng)瓶皿的底壁。一般來說，原代培養(yǎng)物未達到生長基質(zhì)的80%表面面積，不要急于傳代，對于擬行首次傳代的培養(yǎng)物更如此。Sf9的分裂周期大概是27小時左右現(xiàn)在是14頁\一共有20頁\編輯于星期日Sf9傳代的方法1）吸取或者傾出舊培養(yǎng)液。2）加入一定量的新培養(yǎng)基，用吸管吸取培養(yǎng)液，反復吹打瓶皿底壁，使半貼壁的細胞脫離瓶皿底壁。吹打過程須有序進行，亦即要從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的邊緣地帶和四角處，確保瓶皿底壁各處的細胞均被吹打脫離。吹打時動作不宜過猛，吹出液體的力度要適中，否則會直接損傷細胞并產(chǎn)生能傷害細胞的氣泡?；蛘呤辜毎槠龆?。經(jīng)吹打后，得到細胞懸液?，F(xiàn)在是15頁\一共有20頁\編輯于星期日Sf9傳代的方法3）接種在新的培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。一般接種兩個或者多個培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。有時候，傳代僅為了使培養(yǎng)物經(jīng)歷并適應傳代處理過程，在培養(yǎng)物細胞數(shù)量不大的情況下，傳代時還只是接種在一個培養(yǎng)瓶皿內(nèi)。加入培養(yǎng)液。（平時不做實驗時，只需要傳一瓶）。（以1：5或更多為宜，每2-3天傳代一次）28℃培養(yǎng)（不用CO2培養(yǎng)箱）。

4）送入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。現(xiàn)在是16頁\一共有20頁\編輯于星期日細胞培養(yǎng)－換液對于像Sf9這樣的半貼壁的培養(yǎng)物，可按如下步驟操作：吸去或傾出（部分或全部）舊培養(yǎng)液。加入新鮮的培養(yǎng)液。加入的量與換液前的量相同。放回原來的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)?，F(xiàn)在是17頁\一共有20頁\編輯于星期日轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程。化學包括：①DEAE-葡聚糖法②磷酸鈣法③人工脂質(zhì)體法物理包括：①顯微注射②電穿孔③基因槍*Bacmid現(xiàn)在是18頁\一共有20頁\編輯于星期日Bac-to-Bacexpressionsystem桿狀病毒表達系統(tǒng)（BaculovirousExpressionVectorSystem,BEVS）與細菌，酵母，哺乳動物細胞一起被公認為當今世界的基因工程的四大表達系統(tǒng)?，F(xiàn)在是19頁\一共有20頁\編輯于星期日特點能對高效表達的蛋白質(zhì)進行較完善的翻譯后加工，如糖基化，磷酸化，?；?，信號肽的切除等；與其他真和細胞表達系統(tǒng)相比能獲得重組蛋白的高水平表達，最高甚至可達到細胞總蛋白的50%；對脊椎動物無感染性，并且也已經(jīng)證明它們的啟動子在大多數(shù)的哺乳動物細胞中也是沒有活性的，