微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)

第一章普通光學(xué)顯微鏡的使用一、普通光學(xué)顯微鏡

現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像，由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。

第一頁(yè)，共23頁(yè)。油鏡：放大倍數(shù)最大，可達(dá)100x，使用時(shí)需要在載玻片和鏡頭之間滴加鏡油。1）增加照明亮度2）增加顯微鏡的分辨率

第二頁(yè)，共23頁(yè)。第三頁(yè)，共23頁(yè)。第四頁(yè)，共23頁(yè)。二、使用前準(zhǔn)備：1）光源調(diào)節(jié)自帶光源或自然光源2）目鏡調(diào)節(jié)雙筒顯微鏡的目鏡間距可以適當(dāng)調(diào)節(jié)，左目鏡上一般還配有屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，可以適應(yīng)眼距不同或雙眼視力有差異的觀察者。3）聚光器調(diào)節(jié)光圈、光源亮度、聚光器高度第五頁(yè)，共23頁(yè)。三、顯微觀察

1）低倍鏡觀察：個(gè)體較大的微生物如酵母菌的觀察，也用來(lái)確定高倍鏡的觀察視野。養(yǎng)成好的調(diào)焦習(xí)慣：側(cè)面觀察2）高倍鏡觀察：個(gè)體較小微生物的觀察。適當(dāng)調(diào)節(jié)光圈及視野亮度。物鏡同焦3）油鏡觀察：主要用來(lái)觀察細(xì)菌。香柏油，光圈，照明

第六頁(yè)，共23頁(yè)。一般情況下，應(yīng)遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察程序，因?yàn)榈捅稊?shù)物鏡視野相對(duì)大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)及確定檢查的位置。注意：切不可將高倍鏡轉(zhuǎn)動(dòng)經(jīng)過(guò)加有鏡油的區(qū)域。按照說(shuō)明書(shū)對(duì)顯微鏡進(jìn)行清潔保養(yǎng)。第七頁(yè)，共23頁(yè)。第二章細(xì)菌制片一、涂片

取一塊載玻片，各滴一小滴蒸餾水于載玻片中央；用接種環(huán)無(wú)菌操作在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上挑取適量菌苔，將沾有菌苔的接種環(huán)置于載玻片上的蒸餾水中涂抹，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜。若用液體培養(yǎng)物涂片，可用接種環(huán)蘸取1－2環(huán)菌液直接涂于載玻片上。第八頁(yè)，共23頁(yè)。二、干燥自然干燥、用電吹風(fēng)干燥。三、固定

涂菌面朝上，通過(guò)火焰2-3次。四、鏡檢

第九頁(yè)，共23頁(yè)。第十頁(yè)，共23頁(yè)。第三章細(xì)菌的革蘭氏染色微生物中的細(xì)菌，其細(xì)胞小而透明，用壓滴片或懸滴片在光學(xué)顯微鏡下觀察時(shí)，菌體和背景沒(méi)有明顯的明暗差，不易看清其形態(tài)，更難以識(shí)別它們的結(jié)構(gòu)。因此，需要對(duì)菌體進(jìn)行染色，借助于染料使菌體著色后顏色的反襯作用，可以十分清楚地觀察到細(xì)菌的形狀、基本結(jié)構(gòu)（壁、膜、細(xì)胞質(zhì)、核及內(nèi)含物）及附屬結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、菌毛、芽孢等）。第十一頁(yè)，共23頁(yè)。革蘭氏染色

1.制片取活躍生長(zhǎng)期菌種按常規(guī)方法涂片(不宜過(guò)厚)、干燥和固定。2.初染滴加草酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色1min后傾去染液，水洗至流出水無(wú)色。第十二頁(yè)，共23頁(yè)。

3.媒染先用碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min，傾去碘液，水洗至流出水無(wú)色。4.脫色將玻片上殘留水用吸水紙吸去，在白色背景下用滴管加95%乙醇脫色(一般20-30s)，當(dāng)流出液無(wú)色時(shí)立即用水洗去乙醇。第十三頁(yè)，共23頁(yè)。5.復(fù)染將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復(fù)染液染色2min，水洗，吸去殘水晾干。6.鏡檢油鏡觀察。第十四頁(yè)，共23頁(yè)。第十五頁(yè)，共23頁(yè)。革蘭氏陰性菌：

細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，所以用乙醇脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。第十六頁(yè)，共23頁(yè)。革蘭氏陽(yáng)性菌：細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色，呈現(xiàn)藍(lán)紫色。第十七頁(yè)，共23頁(yè)。第四章真菌形態(tài)觀察一、酵母菌形態(tài)觀察及死活細(xì)胞鑒別

單細(xì)胞的酵母菌個(gè)體是常見(jiàn)細(xì)菌的幾倍甚至幾十倍，一般通過(guò)美藍(lán)染液水浸片法或水一碘液浸片法來(lái)觀察酵母菌形態(tài)。

第十八頁(yè)，共23頁(yè)。1、美藍(lán)染液水浸片法

滴加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液于載玻片中央，無(wú)菌操作用接種環(huán)由釀酒酵母麥芽汁斜面培養(yǎng)物挑取少許菌體置于染液中，混合均勻。

用鑷子取一塊蓋玻片，將蓋玻片一邊與菌液接觸，緩慢將蓋玻片傾斜并覆蓋在菌液上。第十九頁(yè)，共23頁(yè)。

將制片放置3min后，用低倍鏡及高倍鏡觀察酵母菌形態(tài)，并根據(jù)細(xì)胞顏色區(qū)分死活細(xì)胞。

染色30mm后再次觀察，注意死活細(xì)胞比例是否發(fā)生變化。

第二十頁(yè)，共23頁(yè)。美藍(lán)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，其氧化型呈藍(lán)色，還原型無(wú)色。由于新陳代謝，活細(xì)胞胞內(nèi)有較強(qiáng)還原能力，使美藍(lán)由藍(lán)色氧化型轉(zhuǎn)變成無(wú)色的還原型，染色后活細(xì)胞呈無(wú)色。死細(xì)胞或代謝能力微弱的衰老細(xì)胞胞內(nèi)還原能力弱，染色后細(xì)胞呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。第二十一頁(yè)，共23頁(yè)。