蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)相互作用現(xiàn)在是1頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)并明確其相互作用的生物學意義蛋白質(zhì)相互作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)相互作用的核心“種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反映了遺傳這樣一種本質(zhì)現(xiàn)象可研究對象合適的研究方法現(xiàn)在是2頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用需要微觀和宏觀的結合象與象的一部分現(xiàn)在是3頁\一共有64頁\編輯于星期五定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎Input：10~20mgtotalproteinsIPsample：Immunoprecipitatedfrom1000mgoftotalproteins現(xiàn)在是4頁\一共有64頁\編輯于星期五定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎Relativeexposurelevel現(xiàn)在是5頁\一共有64頁\編輯于星期五

研究蛋白質(zhì)相互作用的意義1、蛋白質(zhì)間的相互作用是細胞生命活動的基礎。2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用的主體。蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)揮其功能的主要活動?，F(xiàn)在是6頁\一共有64頁\編輯于星期五穩(wěn)定相互作用形成蛋白質(zhì)復合體

（proteincomplex）瞬時相互作用（enzyme-substrate）生物學效應穩(wěn)定的相互作用與瞬間的相互作用共同構成蛋白質(zhì)相互作用的內(nèi)涵?，F(xiàn)在是7頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用是為了研究相應的生物學功能確定研究目標尋找相互作用建立相互作用網(wǎng)絡和功能體系現(xiàn)在是8頁\一共有64頁\編輯于星期五從蛋白質(zhì)相互作用到生物學功能。運用蛋白質(zhì)直接相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用的生物學意義。容易犯的錯誤：研究一大堆的蛋白相互作用，卻不知道這些相互作用有什么生物學意義。從物學功能到蛋白質(zhì)相互作用。通過改變生物學現(xiàn)象，分析蛋白質(zhì)間的遺傳相互作用，進一步研究相關蛋白質(zhì)的相互作用。容易犯的錯誤：找到了平行變化的不相關蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在是9頁\一共有64頁\編輯于星期五發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用遺傳功能分析序列與結構比較模擬驗證蛋白質(zhì)相互作用不同方法的交叉驗證不同生物體系中驗證現(xiàn)在是10頁\一共有64頁\編輯于星期五ProteininteractionAffinity:A+B=ABKd=[A][B]/[AB],Kd:dissociationconstantInteractionKdStreptavidin-biotinbinding10-14MAntibody-antigeninteraction(good)10-8-10-10MAntibody-antigeninteraction(weak)10-6MEnzyme-substrate10-6-10-10M蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用現(xiàn)在是11頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學技術）現(xiàn)在是12頁\一共有64頁\編輯于星期五Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結合）Westernblot：變性抗原，主要用于檢測蛋白質(zhì)的存在與否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特異性結合：Pr1－Ab－Pr2抗體篩庫：cDNA表達庫，抗體結合表達的蛋白質(zhì)，從而得到基因。已經(jīng)被質(zhì)譜和PCR所淘汰現(xiàn)在是13頁\一共有64頁\編輯于星期五Westernblot1、電轉(zhuǎn)移效率2、PVDF膜的充分浸潤3、轉(zhuǎn)移液中有太多的SDS4、膜的損壞5、轉(zhuǎn)移時膠和膜沒有完全接觸6、抗體的問題7、抗體的濃度太高或太低8、還原性物質(zhì)的存在9、封閉不充分現(xiàn)在是14頁\一共有64頁\編輯于星期五SDS－PAGEacrylamide的濃度蛋白質(zhì)上樣的量相鄰泳道的蛋白質(zhì)量、離子強度和樣品體積轉(zhuǎn)移膜：PVDF膜nitrocellulose膜抗體現(xiàn)在是15頁\一共有64頁\編輯于星期五免疫共沉淀免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特異性結合：Pr1－Ab－Pr2現(xiàn)在是16頁\一共有64頁\編輯于星期五免疫共沉淀12354抗體很差，Westernblot問題Loading比例不對樣品太多正確現(xiàn)在是17頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學技術）現(xiàn)在是18頁\一共有64頁\編輯于星期五Affinityinteraction（親和作用）GSTpulldown：已知蛋白質(zhì)和GST融合，與細胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結合的新蛋白質(zhì)。GSTtag。Biotin－Avidin結合：Biotin標記已知蛋白質(zhì)，通過Avidin結合biotin標記的蛋白質(zhì)，從而得到與biotin標記蛋白結合的新蛋白質(zhì)。優(yōu)點是biotin－avidin的結合是最牢靠的；缺點是細胞內(nèi)結合biotin的蛋白質(zhì)很多。各種不同的tag。許多現(xiàn)在是19頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution現(xiàn)在是20頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTpulldownGSTfusionprotein不夠純，用作bait會產(chǎn)生太多的非特異性蛋白質(zhì)污染?，F(xiàn)在是21頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTpulldown現(xiàn)在是22頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTPulldownbindingwashelution現(xiàn)在是23頁\一共有64頁\編輯于星期五Biotin－Avidin結合：生物界最穩(wěn)定的結合之一現(xiàn)在是24頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學技術）現(xiàn)在是25頁\一共有64頁\編輯于星期五Yeasttwo-hybrid（酵母雙雜交）

發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)

鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用

確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團現(xiàn)在是26頁\一共有64頁\編輯于星期五lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ現(xiàn)在是27頁\一共有64頁\編輯于星期五發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)BDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因庫Marker2現(xiàn)在是28頁\一共有64頁\編輯于星期五確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白蘭白白現(xiàn)在是29頁\一共有64頁\編輯于星期五鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2蘭：相互作用白：不相互作用現(xiàn)在是30頁\一共有64頁\編輯于星期五Two-Hybrid的優(yōu)點：是酵母細胞內(nèi)的invivo相互作用。只需要cDNA，簡單。弱的相互作用也能檢測到。現(xiàn)在是31頁\一共有64頁\編輯于星期五Two-Hybrid的缺點：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用。酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾。自身激活報告基因。都基因庫的要求比較高，單向1/3是inframe蛋白質(zhì)毒性。第三者Z插足介導的相互作用。假陽性?，F(xiàn)在是32頁\一共有64頁\編輯于星期五lacZUASDBXlacZDBXAutoactivationBDXMarker1ADYlacZUASADYlacZADYMarker2現(xiàn)在是33頁\一共有64頁\編輯于星期五Phagedisplay（噬菌體展示）現(xiàn)在是34頁\一共有64頁\編輯于星期五Phagedisplay（噬菌體展示）Phagedisplay的最大優(yōu)點是數(shù)量大細胞：108~109細菌：1010Phage：1012尋找受體的配體7肽：8x1016現(xiàn)在是35頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學技術）現(xiàn)在是36頁\一共有64頁\編輯于星期五SPRisusedtomonitorinteractionsoccurringinabiospecificsurfaceonametallayerbymeasuringchangesinthesoluteconcentrationatthissurfaceasaresultoftheinteractions.SurfacePlasmonResonance現(xiàn)在是37頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是38頁\一共有64頁\編輯于星期五SPR優(yōu)點：無標記、實時Label-freedetectionSRPdoesnotrequireanylabelsorreportergroupstodetectbiomolecularinteractions.Itfollowseverystepinamulti-stepanalysisprocedure,incontrasttolabel-basedmethodsthatoftenonlyreportthefinalstep.RealtimemeasurementTheprogressofinteractionsisdisplayeddirectly,asaplotofresponse(whichisdirectlyrelatedtoconcentrationchangesatthesurface)againsttime.Immediatefeedbackonthestatusofaninteractionspeedsupassaydevelopmentandanalysis.Theresultscanbeprocessedfurtheraftertherun,forexampletoextractkineticconstantsfortheinteraction.現(xiàn)在是39頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學技術）現(xiàn)在是40頁\一共有64頁\編輯于星期五DonorAcceptor(2-10nm)

ExcitationfrequencyEmissionfrequency=Excitationfrequency

EmissionfrequencyFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)現(xiàn)在是41頁\一共有64頁\編輯于星期五Donorisexcitedatthemaximumabsorbancewavelength(380nanometers)ofthedonorAcceptorsignalisincreasedattheacceptoremissionmaximum(510nanometers)現(xiàn)在是42頁\一共有64頁\編輯于星期五ColordefiningGFPmutation(source)Blue(BFP)Y66HGreen(GFP)Y66WCyan(CFP)S65TYellowish(YFP)S65G,T203YRed(D.s.RFP)D.striataExcitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLowWavelengthoftheFluorescentProteins現(xiàn)在是43頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是44頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是45頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是46頁\一共有64頁\編輯于星期五

Measureinteractionsbetweentwoproteinsin vivoVerysensitiveExcellentresolutionHelpfulincharacterizingmajorconformational changesinmacromoleculesDeterminetheinteractionqualitativelyand quantitativelyAdvantagesofFRET現(xiàn)在是47頁\一共有64頁\編輯于星期五LimitationsofFRETFRETonlyoccurswhenthetwofluorophoresarewithin2-10nmofeachother,whichmeansthatthefluorophoresmustbebroughttogetherviaverycloseprotein-proteininteractions.Requireexpensiveequipment.RequirelabelingofproteinsusingfluorophoreorGFPfusion現(xiàn)在是48頁\一共有64頁\編輯于星期五Proteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學技術）有專門的課題加以介紹現(xiàn)在是49頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用的單分子技術：原子力相互作用現(xiàn)在是50頁\一共有64頁\編輯于星期五遺傳功能分析利用功能缺陷和互補來分析不同蛋白質(zhì)間的相互關系。不是蛋白質(zhì)直接相互作用的證據(jù)，但可以提供進一步研究的目標。現(xiàn)在是51頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)遺傳相互作用（geneticinteraction）是功能性相互作用有A：小量表達；有B：無表達；有C：無表達ABCABC現(xiàn)在是52頁\一共有64頁\編輯于星期五有A和B：表達增加；有A和C：小量表達；有B和C：無表達ABCABC現(xiàn)在是53頁\一共有64頁\編輯于星期五有A、B和C：高表達在A、B和C的蛋白質(zhì)復合體中，A是和基因調(diào)控區(qū)結合并有小的轉(zhuǎn)錄活性；B可以和A結合促進A的轉(zhuǎn)錄活性；C本身不能直接促進A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通過B的介導進一步促進轉(zhuǎn)錄。ABC現(xiàn)在是54頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)直接相互作用：從蛋白質(zhì)物理的相互作用