第四章-氨基酸-肽和蛋白質(zhì)

第四章氨基酸、肽和蛋白質(zhì)主要內(nèi)容第一節(jié)氨基酸第二節(jié)肽第三節(jié)蛋白質(zhì)第四節(jié)氨基酸及蛋白質(zhì)的純化和鑒定——蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子氨基酸第一節(jié)氨基酸實(shí)驗(yàn)證據(jù)蛋白質(zhì)和多肽的肽鍵可被催化水解酸/堿能將蛋白完全水解

酶水解一般是部分水解得到各種AA的混合物得到多肽片段和AA的混合物構(gòu)成蛋白質(zhì)的AA只有20余種，且都是α-氨基酸。除甘氨酸外，19種AA都具有旋光性。除胱氨酸和酪氨酸外，其余AA都能溶于水。氨基酸排列方式的多樣性決定了蛋白質(zhì)的多樣性,從而決定生物界的多樣性!結(jié)構(gòu)通式氨基酸的定義按Ｒ基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類：１、脂肪族aa：中性、含羥基或硫、酸性aa及其酰胺、堿性aa一、氨基酸的分類２、芳香族aa３、雜環(huán)aa按Ｒ基的極性性質(zhì)分類：１、非極性Ｒ基aa２、不帶電荷的極性Ｒ基aa3、帶正電荷的Ｒ基aa4、帶負(fù)電荷的Ｒ基aa二、氨基酸的酸堿性質(zhì)（一）兼性離子H3N—CH—COOHR+（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+（pH=pI）H2N—CH—COO-R（pH＞pI）（二）氨基酸的解離（三）氨基酸的等電點(diǎn)當(dāng)溶液為某一pH值時(shí)，AA主要以兼性離子的形式存在，分子中所含的正負(fù)電荷數(shù)目相等，凈電荷為0。這一pH值即為AA的等電點(diǎn)（pI）。在pI時(shí)，AA在電場(chǎng)中既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng)，即處于兩性離子狀態(tài)。Ka1*Ka2=……pI=(pK’1+pK’2)/2側(cè)鏈不含離解基團(tuán)的中性AA甘氨酸滴定曲線pI

取決于兩性離子(兼性離子)兩邊pK’值的算術(shù)平均值酸性AA：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2堿性AA：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2對(duì)于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的AA（四）氨基酸的甲醛滴定原因原理應(yīng)用

NH2OHRCHCOOH+HNO2RCHCOOH+H2O+N2VanSlyke

法測(cè)氨基氮（體積）的基礎(chǔ)，N2中的1/2為氨基氮。

氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度測(cè)定原理。1.與亞硝酸反應(yīng)（一）α-氨基參加的反應(yīng)三、氨基酸的化學(xué)性質(zhì)最經(jīng)典、最易進(jìn)行的親核取代反應(yīng)之一丹磺酰氯：用于多肽N末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測(cè)定！2.與?；噭┓磻?yīng)NO2FO2N+H2N—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱堿性DNP-氨基酸（黃色）DNFBSanger法測(cè)定N末端氨基酸基礎(chǔ)3.烴基化反應(yīng)—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITC苯氨基硫甲酰衍生物苯乙內(nèi)硫脲衍生物Edman降解法基礎(chǔ)

R’COOHR’COOC=O+H2NCHC=NCHHRHR醛氨基酸Schiff’s堿-H20+H204.形成希夫堿反應(yīng)在生物體內(nèi)經(jīng)AA氧化酶催化即脫去α-氨基而轉(zhuǎn)變?yōu)橥帷?.脫氨基反應(yīng)（2）成酯

NH2

干燥，HCl

RCHCOOH+C2H5OH

回流

RCHCOOC2H5+H2ONH3·Cl保護(hù)羧基（1）與NaOH等形成鹽（二）α-羧基參加的反應(yīng)1.成鹽或酯反應(yīng)

HN-保護(hù)基R—CH-COOH+PCl5

HN-保護(hù)基

R—CH-COCl+POCl3+HCl活化羧基2.成酰氯反應(yīng)

NH2

脫羧酶

R—CH-COOHR-CH2-NH2+CO23.脫羧基反應(yīng)

YNHONH2NH2

R—CH—C—OCH3

YNHOHNO2

R—CH—C—NHNH2

YNHO

R—CH—C—N-—N+N+2H2O

肼酰化氨基酰肼?；被／B氮肽的人工合成4.疊氮反應(yīng)（三）羧基和氨基都參加的反應(yīng)1、成肽反應(yīng)2、與茚三酮的反應(yīng)及其應(yīng)用特異性顯色及測(cè)定Tyr酚基在3和5位上易發(fā)生親電取代反應(yīng)，如碘化和硝化黃色反應(yīng)1、酪氨酸Tyr（四）側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)Tyr與重氮苯磺酸生成橘黃色化合物，用于檢測(cè)酪氨酸Pauly反應(yīng)精氨酸Arg側(cè)鏈胍基與環(huán)己二酮生成縮合物2、堿性AA色氨酸Trp側(cè)鏈吲哚基能被N-溴代琥珀酰亞胺氧化——分光光度法測(cè)定Trp含量甲硫氨酸Met側(cè)鏈上甲硫基：強(qiáng)親核基團(tuán)與烴化試劑成锍鹽保護(hù)巰基3、含硫AA半胱氨酸Cys的巰基不穩(wěn)定，易被氧化成二硫鍵，二硫鍵可被氧化劑（過甲酸）以及還原劑（巰基化合物）打開?；腔彼崤c二硫硝基苯甲酸發(fā)生硫醇-二硫化物交換pH8.0時(shí)412nm最大光吸收—分光光度法測(cè)定-SH四、AA構(gòu)型和光譜性質(zhì)（一）AA構(gòu)型天然AA主要為L(zhǎng)構(gòu)型。（二）氨基酸的光譜性質(zhì)紫外吸收光譜可見光區(qū)：無吸收遠(yuǎn)紫外和紅外區(qū)：都吸收近紫外區(qū)（200—400nm）：酪氨酸Tyr/色氨酸Trp/苯丙氨酸Phe

原因：芳香族氨基酸

不飽和體系Trp280nmTyr275nmPhe257nm蛋白質(zhì)含量測(cè)定280nm（一）肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)第二節(jié)肽①肽鍵中C-N鍵有部分

雙鍵性質(zhì)

——不能自由旋轉(zhuǎn)②組成肽鍵原子處于同一平面（肽平面）③鍵長(zhǎng)及鍵角一定④大多數(shù)情況以反式

結(jié)構(gòu)存在（一）肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)共價(jià)主鏈

（二）肽的物理化學(xué)性質(zhì)肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。等電點(diǎn)（兩性）。酸堿性質(zhì)取決于：

—α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團(tuán)的解離肽的物理性質(zhì)肽的化學(xué)性質(zhì)1與氨基酸相似之處?酸、堿性：以內(nèi)鹽形式存在，有等電點(diǎn)。?-COOH：脫羧反應(yīng)。2與氨基酸的區(qū)別氨基酸多肽（n≥3）：縮二脲反應(yīng)—紫色（縮二脲反應(yīng)）硫酸銅，OH-?-NH2：與亞硝酸反應(yīng)、?；磻?yīng)等。1谷胱甘肽（γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）谷胱甘肽，GSH，具有解毒功能，也是細(xì)胞內(nèi)的重要還原劑。（三）天然多肽舉例2血管緊張肽Ⅱ

存在于血液中的一種激素，名叫血管緊張肽Ⅱ，能調(diào)節(jié)血壓，系八肽結(jié)構(gòu)3催產(chǎn)素

由垂體后葉分泌的催產(chǎn)素則為九肽，臨床上主要用于產(chǎn)后子宮收縮不良和產(chǎn)后子宮出血，某些條件下也可用于催產(chǎn)。1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而來

——第一重要、首要的物質(zhì)第三節(jié)蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)通論（一）蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類１、元素組成２、蛋白質(zhì)的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近于16%

蛋白質(zhì)含量=每克樣品中含氮的克數(shù)6.25凱氏定氮法：３、蛋白質(zhì)的分類（1）依據(jù)外形分類球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)膜蛋白質(zhì)

（2）依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類簡(jiǎn)單蛋白結(jié)合蛋白（二）蛋白質(zhì)的大小與分子量“前提”：對(duì)任一種給定的蛋白質(zhì)，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長(zhǎng)度方面都應(yīng)是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子蛋白質(zhì)與多肽無嚴(yán)格的界線

——通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500（三）蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子大小和形狀蛋白質(zhì)是高分子化合物蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散和沉降蛋白質(zhì)的粘度

蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)（四）蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次結(jié)構(gòu)層次二、蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)（二）二級(jí)結(jié)構(gòu)

1、α-螺旋

α-螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：多肽鏈主要骨架圍繞螺旋中心軸螺旋式上升，每轉(zhuǎn)一圈上升3.6個(gè)氨基酸殘基，向上平移5.4?，每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升1.5?；相鄰的“螺旋圈”之間形成鏈內(nèi)氫鍵，即每一個(gè)肽單元的N-H與前面隔三個(gè)肽單元的C=O形成氫鍵，氫鍵的取向與螺旋中心軸幾乎平行，通常所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。α-螺旋構(gòu)象靠氫鍵維持，若破壞氫鍵，α-螺旋構(gòu)象破壞，肽鏈松散。

2、-折疊-折疊結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：肽鏈呈現(xiàn)平行折疊延伸結(jié)構(gòu)。肽鏈各肽鍵的氨基與羰基氧原子之間形成氫鍵。3、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)形成類型的決定因素：

肽段上氨基酸殘基側(cè)鏈的長(zhǎng)短。（1）R基小，且不帶電荷的AA,易形成α-螺旋。例如：多聚Ala；（毛發(fā)中的角蛋白整條鏈為α-螺旋）（2）R基太短，卻難以盤曲，只能折疊成片層狀，例如：蠶絲蛋白含45%甘和32%丙，故有大量片層結(jié)構(gòu)存在；（3）R基太大，不易形成螺旋狀或折疊成片層，而呈無定形線狀結(jié)構(gòu)。例如：異亮、色和苯丙等，側(cè)鏈緊靠排列在一起時(shí)，由于肽空間障礙較大。（三）三級(jí)結(jié)構(gòu)在α-螺旋、β-折疊以及無定形線狀等二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，受側(cè)鏈以及各主鏈構(gòu)象單元間的相互作用，從而進(jìn)一步卷曲、折疊成具有一定規(guī)律性的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。大多數(shù)蛋白質(zhì)都具有纖維狀或球狀的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

肌紅蛋白(Mb)N端

C端纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域大分子蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域(domain)。

有些蛋白質(zhì)由兩條或兩條以上具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈構(gòu)成。每條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈就稱為一個(gè)亞基。多個(gè)亞基通過非共價(jià)鍵（氫鍵、鹽鍵、疏水鍵等鍵）聚合而成一定空間結(jié)構(gòu)的聚合體，稱蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。（四）四級(jí)結(jié)構(gòu)亞基是肽鏈但肽鏈不一定是亞基。

血紅蛋白，由兩條α-鏈（α-亞基）和兩條β-鏈（β-亞基）構(gòu)成的α2β2四聚體。每個(gè)亞基由一條多肽鏈和一個(gè)血紅素組成。四級(jí)結(jié)構(gòu)反映蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基間的相互作用，但不包括亞基內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)。示例蛋白結(jié)構(gòu)詳見第5章（五）蛋白質(zhì)分子中的副鍵

1、氫鍵；2、鹽鍵；3、疏水鍵；4、二硫鍵1.氫鍵由分子中與電負(fù)性較強(qiáng)的原子相結(jié)合的氫原子（例N-H）和氧（例C=O）及氮等原子相互吸引而成。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要依賴于氫鍵的作用，可存在于一條肽鍵的兩圈α-螺旋之間，或存在于兩條肽鍵之間（β-折疊），氫鍵的鍵能很小，屬微弱的次級(jí)鍵，但由于多肽鏈中所有的氨基酸殘基都可形成氫鍵，因此量多，從而使氫鍵成為維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要副鍵。用濃尿素或胍溶液破壞氫鍵時(shí)，可破壞其空間構(gòu)象，從而使多肽鏈松散開來。2.鹽鍵

由正負(fù)離子內(nèi)的靜電吸引所形成的化學(xué)鍵。蛋白質(zhì)分子中有大量的極性氨基酸，如Asp、Glu帶負(fù)電荷COO-；Arg，Lys，His帶正電荷-NH3+，兩者之間通過靜電吸引形成離子鍵（鹽鍵）。絕大多數(shù)分布在蛋白質(zhì)分子表面，使蛋白質(zhì)易溶于水或具有兩性電離的性質(zhì)。3.疏水鍵

氨基酸側(cè)鏈上的非極性基團(tuán)在溶液中，為了避開水相，相互間群集在一起而成的作用力，疏水基團(tuán)之間的作用力。例如色氨酸的吲哚環(huán)和支鏈氨基酸的-R基都屬于非極性基，它們具有疏水性，在水溶液中，它們脫離水分子而趨向于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，以形成疏水基團(tuán)之間的作用力。疏水鍵在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性上起著重要作用。4.二硫鍵（鍵能很大）

由兩個(gè)半胱氨酸的-SH氧化脫氫，以-S-S-相連而成，二硫鍵可將不同肽鏈或同一條肽鍵的不同部分連接起來，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象起著重要作用。二硫鍵一旦破壞，蛋白質(zhì)生物活性就喪失。三、蛋白質(zhì)功能的多樣性1.催化功能-酶2.調(diào)節(jié)功能-激素、基因調(diào)控因子3.轉(zhuǎn)運(yùn)功能-膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、蛋、谷蛋白5.運(yùn)動(dòng)功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結(jié)構(gòu)成分-皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.異常功能

同源蛋白質(zhì)：來自不同生物體、

執(zhí)行同一/相似功能的蛋白質(zhì)

同種蛋白質(zhì)：來自相同生物體、

執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)

1、同源蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的AA序列與生物進(jìn)化（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化一百多個(gè)AA殘基

MW約12.5×103

28個(gè)不變殘基

細(xì)胞色素C的AA序列差異可用于核對(duì)各物種間的分類學(xué)關(guān)系以及繪制系統(tǒng)樹/進(jìn)化樹。

2、細(xì)胞色素C與系統(tǒng)樹invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences1、氧合血紅蛋白（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源該酶類活性中心的Ser殘基起關(guān)鍵作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶和纖溶酶有序列同源性對(duì)底物偏愛不同2、絲氨酸蛋白酶類卵清中的溶菌酶（lysozyme）α-乳清蛋白（lactalbumin）——三級(jí)結(jié)構(gòu)很相似也可能具有共同的祖先。3、一些功能差異很大的蛋白質(zhì)（一）肽的人工合成

保護(hù)（氨基、羧基、側(cè)鏈活性基團(tuán)）

活化（氨基、羧基）

縮合劑

（二）胰島素的人工合成

（三）固相肽合成五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成第四節(jié)氨基酸及蛋白質(zhì)的純化和鑒定蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等結(jié)晶一、前處理依樣品而定，方法多種多樣。（一）沉淀法【溶解度差別】二、粗分級(jí)分離蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀析出【分離】膠體性質(zhì)膠體溶液的特點(diǎn)：分子直徑在1-100nm內(nèi)溶于水不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和pI沉淀法等（1）可逆沉淀【非變性沉淀】：鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（（NH4）2SO4）有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用等電點(diǎn)沉淀蛋白溶液的pH值=蛋白的pI值調(diào)整溶液pH，不同蛋白在各自pI處依次沉淀強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沉淀不能再重新溶解如加熱沉淀、強(qiáng)酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等（2）不可逆沉淀【變性沉淀】重金屬鹽沉淀與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽生物堿試劑和某些酸類沉淀與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽加熱變性沉淀天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態(tài)

【根據(jù)分子大小不同】利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜將其與小分子物質(zhì)分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料（二）透析和超過濾血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液加壓血液（三）超速離心

超速離心法既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。高速：25000rpm超速：50000-120000rpmCsCl密度梯度離心蔗糖密度剃度離心（四)根據(jù)電荷不同的分離方法—電泳原理：蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀無關(guān)，僅取決于相對(duì)分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵蛋白質(zhì)顆粒電泳時(shí)遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀等電聚焦電泳（IEF）

通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場(chǎng)作用下自然形成。

雙向凝膠電泳雙向電泳毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳又稱毛細(xì)管區(qū)帶電泳，它是在毛細(xì)管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細(xì)管兩端加高壓直流電實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細(xì)管一端的檢測(cè)器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散的問題，實(shí)現(xiàn)了快速和高效分離。毛細(xì)管電泳是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，被認(rèn)為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測(cè)定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。毛細(xì)管電泳層析技術(shù)氨基酸分離純化的層析技術(shù)蛋白質(zhì)分離純化的層析技術(shù)三、細(xì)分級(jí)分離{層析系統(tǒng)固定相{流動(dòng)相附著在固相上的液體固體氨基酸分離純化的層析技術(shù)

（1）分配層析法的一般原理

——利用AA成分分配系數(shù)的差異{氣體液體吸附固體吸附能力不同分配液體分配系數(shù)不同離子交換離子交換劑親和性不同凝膠多孔凝膠，通過速度不同親和固定相只能與一種組分結(jié)合，——分開其它無親和力的組分

按層析原理分：固定相各組分對(duì)固定相柱固定相裝于柱內(nèi)紙固定相是液體，吸附在濾紙上，將樣品點(diǎn)在紙上，用流動(dòng)相展開薄層將有適當(dāng)粘度的固定相涂在薄板上薄膜與紙層析相似，紙用其它高分子有機(jī)吸附劑代替

按操作形式分：分配柱層析離子交換層析紙層析薄層層析氣液層析高效液相層析蛋白質(zhì)分離純化的層析技術(shù)層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流過此固定相(稱為流動(dòng)相)并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法吸附層析分配層析詳見：氨基酸的分離純化的層析技術(shù)分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。離子交換層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種