原核表達(dá)調(diào)控與色氨酸操縱子

原核表達(dá)調(diào)控與色氨酸操縱子第1頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄：在DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化下，以DNA鏈的一條鏈為模板，按照堿基配對(duì)原則合成RNA鏈的過(guò)程。不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：在DNA雙鏈分子中，轉(zhuǎn)錄通常只在DNA的一條鏈上進(jìn)行，另一條鏈則不能轉(zhuǎn)錄，但可能對(duì)轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用，這種轉(zhuǎn)錄方式稱不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄單位：就是從啟動(dòng)子到終止子的一段DNA序列。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄概述第2頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、基因的編碼鏈和有意義鏈

模板鏈：用于轉(zhuǎn)錄RNA的鏈稱為模板鏈，或負(fù)（－）鏈，又稱無(wú)義鏈。編碼鏈：與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈稱為編碼鏈，或正（＋）鏈，又稱有義鏈。第3頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、轉(zhuǎn)錄的基本要點(diǎn)

底物：NTP；模板：反義鏈；方向：5’→3’；酶：RNA

pol；產(chǎn)物：RNA單鏈第4頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：都是遺傳信息的傳遞第5頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位點(diǎn)核苷酸為＋1。上游序列upstream：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的前面的序列，用負(fù)數(shù)碼（－）表示，起點(diǎn)前一個(gè)核苷酸為－1。下游序列downstream：

轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的后面的序列，用正數(shù)碼（＋）表示。沒(méi)有編號(hào)為○的堿基。第6頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第7頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)原核生物轉(zhuǎn)錄的過(guò)程

RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion，elongation，termination

三過(guò)程；從promoter到terminator稱為transcriptionalunit；原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為

polycistron；轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)記為+1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值。+1

-10

+10upstreamstartpointdownstream第8頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、轉(zhuǎn)錄的起始

關(guān)鍵：全酶能以很高的親和性結(jié)合在啟動(dòng)子promoter；啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。第9頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄的起始核心酶在σ因子幫助下特異性結(jié)合到DNA上；RNA

pol與啟動(dòng)子-35box結(jié)合，形成封閉型起始復(fù)合物；酶滑動(dòng)到-10box，轉(zhuǎn)變成為開(kāi)放型起始復(fù)合物，啟動(dòng)子活化，雙鏈解開(kāi)，模板鏈暴露，插入最初的2個(gè)核苷酸；酶繼續(xù)加上開(kāi)頭的幾個(gè)NTP，形成三元起始復(fù)合物，在RNA鏈合成了8～9個(gè)堿基后，σ因子解離，轉(zhuǎn)錄開(kāi)始。第10頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ModeloftheinteractionbetweenE.coilRNApolymeraseholoenzymeandapromoterDNAIncorporatingthefirstfewNt第11頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸

RNA

pol沿著模板鏈移動(dòng)，RNA鏈不斷延伸，并保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；轉(zhuǎn)錄泡中的DNA螺旋前開(kāi)、后合，RNA延長(zhǎng)，不斷脫離DNA；RNA鏈的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄就會(huì)減慢/停頓。第12頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四17bp螺旋解開(kāi)長(zhǎng)度12bpDNA-RNA復(fù)合體長(zhǎng)度第13頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響RNA延伸速度的因素：①RNA

pol；②暫停信號(hào)：導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速度突然出現(xiàn)變化的特殊序列。GC富集區(qū)：產(chǎn)物RNA不易釋放；IR：產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，妨礙上游的模板恢復(fù)雙鏈。③其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第14頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四NusAprotein：

★69Kd,acidprotein★RNApol-attachingfactor★

ImpelRNApol.pausinginterminatorfor1’-15’andwaitingfor

Rho

factortostoptranscriptionofRNA

★Afterinitiation→substitutingσ→NusA+coreE

antitermination

Nproteinutilizationsubstance第15頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第16頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、原核生物轉(zhuǎn)錄的終止

轉(zhuǎn)錄的終止依賴于RNA產(chǎn)物的特定序列；原核和某些真核生物的終止子要求轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA3’端具有發(fā)夾的二級(jí)結(jié)構(gòu)，莖部富有GC序列；終止子的分類：根據(jù)終止反應(yīng)是否需要ρ蛋白第17頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1、不依賴于ρ因子的終止子（強(qiáng)終止子）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：RNA具有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（富含GC）和隨后polyU片段。作用機(jī)制：RNApol+發(fā)夾結(jié)構(gòu)→轉(zhuǎn)錄暫?！箅S雜合分子不穩(wěn)定的poly(U-dA)→RNA容易從模板上脫落→RNA-DNA-RNApol解聚→轉(zhuǎn)錄終止第18頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第19頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2、依賴于ρ因子的終止子（弱終止子）

ρ因子：55kD，六聚體。能夠利用水解ATP釋放的能量使RNA從三元復(fù)合物中釋放出來(lái)；結(jié)構(gòu)：仍然具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但GC堿基對(duì)含量較少，下游也缺乏polyU結(jié)構(gòu)。第20頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四終止類型回文序列后隨序列不依賴ρ因子的終止子富含GC富含U依賴ρ因子的終止子不富含GC不富含U第21頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)原核生物轉(zhuǎn)錄的調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì)、靈活，又是最為重要、復(fù)雜的調(diào)控；①確定需要轉(zhuǎn)錄基因的起始位點(diǎn)；②精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的水平；③cisfactor與transfactor嚴(yán)格又靈活的互作；④保證RNApol的連續(xù)轉(zhuǎn)錄，準(zhǔn)確終止。第22頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)概念

（一）誘導(dǎo)和阻遏：誘導(dǎo)：酶的合成取決于特定物質(zhì)（常為substrate）的存在。如培養(yǎng)基中乳糖的存在促進(jìn)了E.coli的半乳糖苷酶的合成；阻遏：當(dāng)培養(yǎng)基中某種物質(zhì)（常為product）含量較高，細(xì)胞就關(guān)閉合成這種物質(zhì)的能力。如培養(yǎng)基中Trp的存在抑制了E.coli

Trp的合成；第23頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）調(diào)控的效應(yīng)物調(diào)節(jié)蛋白+小分子物質(zhì)→原核操縱子的誘導(dǎo)/阻遏。這些小分子是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物質(zhì)--效應(yīng)物。誘導(dǎo)物（inducer）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，使其從DNA分子上脫落下來(lái)，RNApol開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。輔阻遏物（co-repressor）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，可以提高調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因的親和性，進(jìn)而關(guān)閉結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。第24頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（三）正調(diào)控和負(fù)調(diào)控

正調(diào)控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。負(fù)調(diào)控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后抑制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。正、負(fù)調(diào)控都存在著誘導(dǎo)和阻遏。第25頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、操縱子理論（operonconcept）定義：原核生物基因表達(dá)和調(diào)控的單元。包括：①結(jié)構(gòu)基因：編碼控制某一代謝途徑的相關(guān)的酶；②調(diào)控元件：是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，包括啟動(dòng)子和操縱基因；③調(diào)節(jié)基因：其產(chǎn)物（調(diào)節(jié)蛋白）能夠識(shí)別并結(jié)合操縱基因，決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與否。主要見(jiàn)于原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、組氨酸操縱子、色氨酸操縱子等第26頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色氨酸操縱子色氨酸操縱子(Trpoperon)是一種重要的操縱子，是聯(lián)合使用或轉(zhuǎn)錄的一組基因，也是用來(lái)編碼生成色氨酸的元件之一。色氨酸操縱子是在許多細(xì)菌存在，但首次在大腸桿菌中得到表征。當(dāng)在環(huán)境中存在足量的色氨酸，它將不被使用。第27頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1.大腸桿菌色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，也是研究得最清楚的操縱子，結(jié)構(gòu)基因依次排列為trpEDC2BA，其中trpGD和trpCF基因融合。2.枯草桿菌色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)有所不同，7個(gè)結(jié)構(gòu)基因中的6個(gè)依次排列為trpEDCFBA，存在于含有12個(gè)結(jié)構(gòu)基因的芳香族氨基酸超操縱子（arooperon），第7個(gè)結(jié)構(gòu)基因，trpG存在于葉酸合成操縱子中，該酶參與Trp和葉酸的合成。有2個(gè)啟動(dòng)子參與調(diào)控，一個(gè)位于arooperon的起始位置，另一個(gè)則位于trpE上游約200bp處。第28頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四RPOLaEDCB

A調(diào)節(jié)基因前導(dǎo)區(qū)弱化子間隔區(qū)結(jié)構(gòu)基因間隔區(qū)調(diào)節(jié)作用601621560159311961350804第29頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Trp的調(diào)控作用途徑

Trp合成途徑較漫長(zhǎng)，消耗大量能量和前體物，受到嚴(yán)格調(diào)控，其中色氨酸操縱子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。調(diào)控作用主要有三種方式：阻遏作用、弱化作用以及終產(chǎn)物Trp對(duì)合成酶的反饋抑制作用。阻遏作用1.trp操縱子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是通過(guò)阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)的。產(chǎn)生阻遏蛋白的基因是trpR，該基因距trpoperon基因簇很遠(yuǎn)。它結(jié)合于trp操縱基因特異序列，阻止轉(zhuǎn)錄起始。在有高濃度Trp存在時(shí)，阻遏蛋白-色氨酸復(fù)合物形成一個(gè)同源二聚體，并且與色氨酸操縱子緊密結(jié)合，因此可以阻止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Trp水平低時(shí)，阻遏蛋白以一種非活性形式存在，不能結(jié)合DNA。在這樣的條件下，trp操縱子被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，同時(shí)Trp生物合成途徑被激活。第30頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四RPOLaEDCB

A高色氨酸時(shí)

低色氨酸時(shí)

AUG前導(dǎo)肽鄰氨基苯甲酸合酶鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶吲哚甘油磷酸合酶色氨酸合酶α和β亞基mRNAmRNA第31頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四弱化作用

trp操縱子轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控是通過(guò)弱化作用（attenuation）實(shí)現(xiàn)的?？莶輻U菌色氨酸操縱子表達(dá)主要受到色氨酸激活RNA結(jié)合蛋白(Trp-activatedRNA-bindingprotein,TRAP）的調(diào)節(jié)。該蛋白與色氨酸結(jié)合被激活后，可與trpE上游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。當(dāng)色氨酸濃度較低時(shí)，TRAP失活，轉(zhuǎn)錄可以繼續(xù)，結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)。第32頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四反饋抑制作用由于基因表達(dá)必然消耗一定的能源和前體物，相對(duì)于阻遏和弱化作用，反饋抑制作用更為經(jīng)濟(jì)和高效。終產(chǎn)物Trp對(duì)催化分支途徑幾步反應(yīng)的酶具有反饋抑制作用，其50%抑制濃度分別為：鄰氨基苯甲酸合酶，0.0015mmol·L-1；鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，0.15mmol·L-1;色氨酸合成酶,7.7mmol·L-1。對(duì)于普通野生菌株，鄰氨基苯甲酸合酶對(duì)Trp合成起到關(guān)鍵調(diào)控作用，常被稱為瓶頸酶；但對(duì)高產(chǎn)Trp工程菌而言，上述任何一種酶的反饋抑制都會(huì)直接影響Trp產(chǎn)量。第33頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四TheBacillussubtilisTRAPProteinCanInduceTranscriptionTerminationintheLeaderRegionoftheTryptophanBiosynthetic(trp)OperonIndependentofthetrpAttenuatorRNA2014第34頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1.InBacillussubtilis,transcriptionofthetryptophanbiosyntheticoperonisregulatedbyanattenuationmechanism.2.Whenintracellulartryptophanlevelsarehigh,theTRAP(trpRNA-bindingattenuationprotein)proteinbindstothe5‘leaderregionofthenascenttrpmRNAandinduces

transcriptiontermination.3.Inlimitingtryptophan,TRAPdoesnotbindandtheoperonistranscribed.TwocompetingRNAsecondarystructurestermedtheantiterminatorandterminator(attenuator)canformintheleaderregionRNA.ResearchBackground第35頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4.In

priorattenuationmodels,theonlyroleofTRAPbindingwastoaltertheRNAsecondarystructuretoallowformationoftheattenuator,whichhasbeenthoughtfunctionasanintrinsictranscriptionterminator.5.However,recentstudieshaveshownthattheattenuatorisnotaneffectiveintrinsicterminator.6.FromthesestudiesitwasnotclearwhetherTRAPfunctionsindependentlyorrequiresthepresenceoftheattenuatorRNAstructure.第36頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Figure1.ModeloftranscriptionattenuationoftheB.subtilistrpoperon.第37頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ResearchPurposes1.ToexaminetheroleoftheattenuatorRNAinTRAP-mediatedtranscriptiontermination,toexaminewhetherTRAPfunctionsindependentlyorrequiresthepresenceofthe

attenuatorRNAstructure.第38頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四MaterialandMethods1.BacterialstrainsandtransformationsE.coliK802wasusedasahostforplasmidconstructionandpropagation.B.subtilisBG2087(argC4)andBG4233(argC4DmtrB)wereusedashostsfortransformationandintegrationofgenefusions.BG4233containsadeletioninmtrB(fromcodons7–62),whichencodesTRAP.第39頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Maincontent1.TRAPinducesefficienttranscriptionterminationwithinthetrpleaderregioninvivowhentheattenuatorismutated.2.TRAPinducesefficienttranscriptionterminationinvivowithinthetrpleaderregioninwhichtheattenuatorsegmentisdeleted.3.MappingthelocationofTRAP-mediatedtranscriptionterminationwithinthemutanttrpleaderregions.4.TRAPdoesnotcauseefficienttranscriptionterminationwithinthemutanttrpleaderregionsinvitro.5.NusAandthetimingofTRAPbindingtothenascentRNAareimportantinTRAP-mediatedtranscriptiontermination.第40頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Results1.TRAPinduces

efficienttranscriptiontermination

withinthetrpleaderregioninvivowhentheattenuatorismutated.A.DiagramdepictingtheWTandmutant

trpattenuatorswithalteredbases

inthestem-loopstructureorU-stretch.第41頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四B.SchematicrepresentationofthetranscriptionalreporterfusionswithlacZthatwereusedtoexamineTRAP-mediatedregulationoftranscriptionterminationinvivo.第42頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第43頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

TheresultsinTable1showthatTRAPisabletoinducetranscriptionterminationinthetrpleaderregiondespitesignificantalterationstothestem-looportotheU-richtractoftheattenuator.Butthelocationwhereterminationoccursintrpleaderregionscontainingalteredattenuatorswillbeaddressedbelow.第44頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.TRAPinducesefficienttranscriptionterminationinvivo

withinthetrpleaderregioninwhichtheattenuator

segmentisdeleted.Figure3.Diagramdepictingdeletionmutationsinthestem-loopandU-stretchofthetrpattenuator.stem-loopofthetrpattenuator108142第45頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第46頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.MappingthelocationofTRAP-mediatedtranscription

terminationwithinthemutanttrpleaderregions.A

(A)SchematicdiagramofRNaseprotectionassays(RPA)using32P-labeledantisenseprobesandcellularRNAfromB.subtilis.第47頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四(B)RNaseprotectionassaystodeterminelocationoftranscriptionterminationintrpleaderregionscontainingmutantattenuatorsinexcesstryptophan.第48頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

TogethertheseresultsdemonstratethattranscriptsfromthetrpE'-'lacZfusioncontainingtheU-stretch(US)ortheDisruptedstem(DS)mutantattenuatorterminateatapproximatelythesamelocationastranscriptsthatterminateattheWTattenuator.第49頁(yè)，共52頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4.TRAPdoesnotcauseefficienttranscriptionterminationwithinthemutanttrplea