感染性疾病標(biāo)志物及快速診斷課件(PPT 134頁)

1、感染性疾病標(biāo)志物及快速診斷技術(shù)第1頁，共134頁。概 述1.感染性疾病：由某種病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病,主要表現(xiàn)為發(fā)熱。 2.病原體：細(xì)菌（含TB）、真菌、支原體、衣原體、病毒、原蟲等第2頁，共134頁。感染的診斷依據(jù)臨床表現(xiàn)：感染的全身中毒癥狀： 畏寒、發(fā)熱、皮疹等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查：血常規(guī)：WBC、DC影像學(xué)檢查：X-RAY、B超病原學(xué)檢查：染色、培養(yǎng)血清學(xué)檢查：抗原或抗體檢測危重病人：臨床表現(xiàn)、WBC+DC 不典型第3頁，共134頁。感染的分類按病原學(xué)分類：細(xì)菌感染（包括結(jié)核）真菌感染病毒感染支原體、衣原體按部位分類：局部感染全身感染第4頁，共134頁。臨

2、床希望第一時間知道的信息感染或非感染細(xì)菌感染或非細(xì)菌感染結(jié)核感染或普通細(xì)菌感染酵母樣真菌感染或絲狀真菌感染白色假絲酵母或其他念珠菌感染曲菌感染或毛霉菌感染因?yàn)樯鲜龈腥局委煼椒ú煌?頁，共134頁。一、免疫學(xué)方法第6頁，共134頁。（一）降鈣素原降鈣素原是正常人血清中存在的含116個氨基酸組成的糖蛋白，最初由甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生，血清水平很低。在非感染或病毒性感染疾病時保持非常低的血清水平，在細(xì)菌性感染時含量升高，并與感染程度和預(yù)后呈正相關(guān)。 PCT含量的變化穩(wěn)定，并出現(xiàn)在疾病的早期（3-4h）。短半衰期(24h)國外把 PCT作為最敏感的感染標(biāo)志。第7頁，共134頁。降鈣素原 PCT : 分子結(jié)構(gòu)

3、血清降鈣素(CT)的前肽物質(zhì)分子量：14.5 kDa由116個氨基酸組成的糖蛋白質(zhì)無激素活性11號染色體上的單拷貝基因轉(zhuǎn)錄甲狀腺濾泡細(xì)胞降鈣素原前體內(nèi)源多肽酶降鈣素原 PCT分解細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白酶正常情況下降鈣素第8頁，共134頁。Linscheid P, et al Crit Care Med 04; 32: 1715-21Endocrinology 03; 144: 5578-84 & 05; 146: 2699-708 在病毒感染時，大量產(chǎn)生的IFN-，將會抑制PCT的激活及產(chǎn)生.因此，病毒感染時，PCT的濃度將會保持在較低的水平Bacterial Infection(e.g.Endoto

4、xin)IL-6IL-6第9頁，共134頁。細(xì)菌感染后PCT快速升高 Kinetics of procalcitonin in iatrogenic sepsis Brunkhorst F.M et al, Intens Care Med 1998,24:888-892第10頁，共134頁。PCT來源Left Lane:正常組, 在不存在感染的情況下，甲狀腺外CT表達(dá)被抑制，而主要局限于甲狀腺和肺的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞有一定程度的表達(dá)Right Lane: 膿毒癥組,在細(xì)菌感染時可誘導(dǎo)全身各種組織多種類型細(xì)胞CT表達(dá)和PCT連續(xù)性釋放第11頁，共134頁。PCT動力學(xué)2-3h開始增加； 6-8h快速

5、升高；12h-48到達(dá)峰值； 2-3d 正常血漿濃度在0.05ng/ml-1000ng/ml半衰為15-20h左右,且不受腎功能影響第12頁，共134頁。PCT檢測方法快速半定量法（PCT-Q）全自動快速定量法（VIDAS)第13頁，共134頁?？焖侔攵糠ǎ≒CT-Q）樣本：200l血清/血漿結(jié)果：30min同膠體金免疫層析法，即在標(biāo)準(zhǔn)品上結(jié)合有膠體金的小鼠單克隆抗降鈣素抗體和綿羊多克隆抗降鈣素抗體，待檢標(biāo)本加上后，示蹤元素即與標(biāo)本中的PCT結(jié)合，形成一個“三明治式”的復(fù)合物，然后通過發(fā)光比色判斷PCT濃度當(dāng)PCT濃度0.5g/ml時，夾心復(fù)合物呈紅色帶，顏色深淺與樣品中的PCT濃度成正比例

6、，未結(jié)合的示蹤物擴(kuò)散到對照區(qū)，結(jié)合并產(chǎn)生了紅色的對照帶。 第14頁，共134頁。全自動快速定量法酶聯(lián)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標(biāo)本要求：靜脈抗凝血注意無菌操作，使用新鮮標(biāo)本，如果4小時內(nèi)不使用，應(yīng)將標(biāo)本放置-20保存。血漿中的PCT非常穩(wěn)定，收集標(biāo)本24h后，PCT濃度在室溫下大約下降12，在4大約下降6 第15頁，共134頁。PCT臨床意義細(xì)菌感染/膿毒癥診斷及嚴(yán)重程度判斷 膿毒癥治療效果監(jiān)測及預(yù)后評估 抗生素的有效管理第16頁，共134頁。細(xì)菌感染診斷及嚴(yán)重程度判斷膿毒性休克嚴(yán)重膿毒癥系統(tǒng)性感染(膿毒癥)局部感染正常值 PCT的濃度隨感染的擴(kuò)散和感染嚴(yán)重程度的加重而升高第17頁，共134頁。膿毒癥

7、患者治療效果及預(yù)后監(jiān)測(n=109)F. Stber, University Bonn, Lecture at ISICEM, Brussels 2001通過PCT不斷在體內(nèi)衰減，反映出抗生素治療策略的成功隨著患者對抗生素治療的響應(yīng)，引起了PCT血中濃度水平的典型變化過程AB-antibiotics第18頁，共134頁?？股赜行Ч芾鞵CT濃度（ng/ml）臨床意義0.05無細(xì)菌感染0.05-0.1非細(xì)菌感染0.1-0.25可能是局部細(xì)菌感染，不建議使用抗生素，6-24小時內(nèi)復(fù)查0.25-0.5局部細(xì)菌感染，建議使用抗生素0.5-2.0嚴(yán)重細(xì)菌感染、膿毒癥2.0-10.0重癥膿毒癥10.0 重

8、度膿毒癥、膿毒性休克或MODS第19頁，共134頁。PCT的臨床應(yīng)用急診住院病房外科手術(shù)血液科內(nèi)科ICU外科ICU兒科急診兒科病房兒科ICU新生兒科嚴(yán)重細(xì)菌感染或膿毒癥的檢測（鑒別診斷）疾病或治療反應(yīng)的監(jiān)測局部與全身性感染膿毒癥的診斷和監(jiān)測新生兒膿毒癥的檢測第20頁，共134頁。 生理性一過性峰值創(chuàng)傷后炎癥綜合癥: 多發(fā)性創(chuàng)傷, 大面積燒傷, 大手術(shù)后 (心臟, 移植, 腹部)使用致炎細(xì)胞因子治療后 (OKT3, 注射 TNF, IL-2, 抗淋巴細(xì)胞球蛋白)某些腫瘤 (甲狀腺髓樣細(xì)胞癌, 肺小細(xì)胞癌和支氣管癌)長時間循環(huán)衰竭 (心源性休克, 出血性休克, 熱休克)PCT水平增加但沒有系統(tǒng)細(xì)菌

9、感染的幾種情況第21頁，共134頁。感染早期 (- 6-12 小時后重復(fù)檢測!)亞急性心內(nèi)膜炎局部感染細(xì)菌感染而PCT不升高的情況第22頁，共134頁。 PCT檢測影響因素受以下因素影響 * 甲狀腺功能 是功能性甲狀腺髓樣癌的腫瘤標(biāo)志物* 腎功能 嚴(yán)重腎功能受損者中水平較高不受以下因素影響* 類固醇藥物* 自身免疫性疾病* 年齡、性別* 免疫功能低下狀態(tài):肝硬化、HIV感染第23頁，共134頁。（二）細(xì)菌內(nèi)毒素革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖（LPS）和蛋白的復(fù)合物，細(xì)菌死亡或自溶后釋放進(jìn)入機(jī)體將會出現(xiàn)發(fā)熱、血壓降低、寒顫、引起DIC、內(nèi)毒素敗血癥等一系列臨床反應(yīng)。第24頁，共134頁。第25

10、頁，共134頁。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測原理：儀器檢測試管內(nèi)反應(yīng)物的光密度OD值，取當(dāng)OD上升到0.02的點(diǎn)的時間作為反應(yīng)時間，該點(diǎn)在反應(yīng)曲線上的位置為濁度開始快速變化的時期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應(yīng)時間，從而判斷內(nèi)毒素的含量動態(tài)濁度法第26頁，共134頁。儀器和試劑BET-24A細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀 MB-80微生物快速動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng) 第27頁，共134頁。標(biāo)本要求患者早上尚未進(jìn)行藥物靜脈治療時: MB-80：“無熱源真空采血管”,靜脈抗凝血 ，采血量2-4ml ，30min內(nèi)送檢BET-24A：抽取1mL靜脈抗凝血，配1mL1號處理液其它體液如腦脊液胸腹水與血標(biāo)本要求相同。注意無菌操作第28頁，共1

11、34頁。內(nèi)毒素活性定量檢測意義G-所致膿毒癥早期鑒別診斷指導(dǎo)抗生素正確使用判定抗感染治療效果幫助判斷患者的預(yù)后第29頁，共134頁。內(nèi)毒素定量檢測的適應(yīng)癥各種急、慢性病理性發(fā)熱患者各種類型“中重度感染、肝病、休克、腸道疾病、臟器功能衰竭、大手術(shù)術(shù)后”患者慢性疾病長期臥床、免疫力低下患者急診及ICU病房收治的生命體征不穩(wěn)定的患者第30頁，共134頁。1.1,3-D-葡聚糖-G試驗(yàn)1，3-D-葡聚糖是酵母和絲狀真菌細(xì)胞壁的多聚糖成分，以假絲酵母菌屬含量最高，而其他微生物動物及人的細(xì)胞成分和細(xì)胞外液都不含這種成分。因此，血液及無菌體液中檢出1，3-D-葡聚糖在很大程度上可以視為IFI 的標(biāo)志，如念珠

12、菌、曲霉、鐮刀霉、酵母和絲孢酵母感染等。目前的檢測方法為G試驗(yàn)，其 原 理 是 1，3-D-葡聚糖有特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子引 起裂解物凝固，故稱為G試驗(yàn)。 國內(nèi)已經(jīng)使用微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)檢測。第31頁，共134頁。標(biāo)本要求采樣過程要求無菌操作常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血取樣（血透患者透析前采血）標(biāo)本類型：抗凝靜脈血，使用無熱原真空采血管采血量：2-3ml，立即混勻半小時內(nèi)送檢。實(shí)驗(yàn)前未打開標(biāo)本在2-8可保存5天。打開后標(biāo)本需在48小時內(nèi)完成檢測。如需長時間儲存，存儲溫度應(yīng)為-70。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測之前要充分混勻第32頁，共134頁。G試驗(yàn)的臨床意義早期、

13、快速診斷侵襲性真菌感染可用于真菌感染早期篩查，適用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、鐮刀菌、地霉、組織胞漿菌和毛孢子菌等，不能用于檢測隱球菌和接合菌感染。對真菌感染癥狀進(jìn)行診斷，陽性結(jié)果代表存在侵襲性真菌感染第33頁，共134頁。（三）半乳甘露聚糖(GM)半乳甘露聚糖(GM) 是一種對熱穩(wěn)定的水溶性的物質(zhì)，是廣泛存在于曲霉和青霉細(xì)胞壁中的一類多糖。一般在曲霉感染者出現(xiàn)臨床癥狀和影像學(xué)檢查異常前數(shù)天，其體內(nèi)循環(huán)中GM 即可呈陽性表達(dá)，其靈敏度和特異度均可達(dá)到80% 以上。原理：是一種微孔板雙抗體夾心法，采用小鼠單克隆抗體EBA-2，檢測人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖。第34頁，共134頁。標(biāo)本要求標(biāo)本采集

14、：靜脈采血5ml（紅帽管）。檢測標(biāo)本：血清標(biāo)本，密封，無菌操作。實(shí)驗(yàn)前未打開標(biāo)本在2-8可保存5天。打開后標(biāo)本需在48小時內(nèi)完成檢測。如需長時間儲存，存儲溫度應(yīng)為-70。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測之前要充分混勻20mg/L膽紅素，或2g/L甘油三酯的脂血，或165mg/L血紅蛋白的溶血標(biāo)本不影響檢測結(jié)果第35頁，共134頁。GM試驗(yàn)臨床意義1.診斷侵襲性真菌感染2.血清GM檢測能區(qū)分侵襲性肺曲霉感染與白色假絲酵母菌、毛霉、肺炎鏈球菌感染和煙曲霉口咽定植。但不能區(qū)分曲霉菌種。3. 評價療效的可靠指標(biāo)第36頁，共134頁。G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)提高對IFI 的診斷。陽性預(yù)測值可達(dá)100%。第3

15、7頁，共134頁。其它新生隱球菌： 循環(huán)夾膜抗原是新生隱球菌病,尤其是新生隱球菌腦膜炎的診斷手段。乳膠法: 5min即可出結(jié)果,特異性達(dá)90-100%,可檢測35ng/ul的抗原ELISA:敏感性高于LA(乳膠凝集),可檢測6ng/ul第38頁，共134頁。（四）結(jié)核分枝桿菌的快速診斷結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，一般需2-4周長成肉眼可見的落菌?？顾崛旧ㄊ菣z測TB的傳統(tǒng)方法，但存在假陽性因此，快速診斷對TB至關(guān)重要。第39頁，共134頁。結(jié)核感染現(xiàn)狀全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化結(jié)核病與艾滋病同時流行結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴(yán)重人口大規(guī)模流

16、動我國是世界上僅低于印度的第二結(jié)核病大國結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動性結(jié)核患者130萬/年死亡13萬/年早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病方法陽性率不到60%第40頁，共134頁。全球結(jié)核疫情第41頁，共134頁。結(jié)核檢測方法一、現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測技術(shù)細(xì)菌學(xué)診斷 涂片、培養(yǎng)免疫學(xué)診斷 抗原、抗體膠體金分子生物學(xué)診斷 PCR二、其它檢測技術(shù)結(jié)核菌素純蛋白衍生物PPD（TST）實(shí)驗(yàn)影像學(xué)檢查第42頁，共134頁。結(jié)核夾層杯技術(shù)結(jié)核感染T細(xì)胞檢測技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)核分枝桿菌的快速診斷第43頁，共134頁。結(jié)核夾層杯技術(shù)原理：通過專用消化滅活液消化組織細(xì)胞和粘蛋白等，將

17、結(jié)核桿菌裸露出來，并結(jié)合高速震蕩，使痰標(biāo)本充分液化而有利于其中的抗酸桿菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上，在夾層杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片針頂出內(nèi)底，經(jīng)封片等步驟后，鏡下檢測抗酸桿菌。第44頁，共134頁。檢測流程示意圖第45頁，共134頁。鏡下比較圖2. 夾層杯法（新方法）：菌量多，背景清晰，易于觀察 圖1. 直接涂片法（傳統(tǒng)方法）：菌量少，背景不清晰第46頁，共134頁。夾層杯診斷技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)陽性率高背景清晰，易于觀察易于標(biāo)準(zhǔn)化檢測速度快生物安全性好夾層杯診斷技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)第47頁，共134頁。結(jié)核夾層杯技術(shù)標(biāo)本要求：（1）痰液要求新鮮，留取清晨深咳出的第一口痰液，留痰時，患者以清水漱口次，然

18、后用力咳出氣管深處的痰（2）用氫氧化鈉處理完全。臨床應(yīng)用：用于結(jié)核分枝桿菌的初篩第48頁，共134頁。結(jié)核感染T細(xì)胞檢測技術(shù)是以ELISPOT技術(shù) 檢測結(jié)核感染的新方法 ，ELISPOT是近20 年發(fā)展起來的檢測抗原特異性T細(xì)胞的技術(shù)，是目前最敏感的檢測抗原特異性T細(xì)胞的方法之一。第49頁，共134頁。-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA，interferon- gamma release assay）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT，Enzyme-Linked ImmunoSpot assay）結(jié)核桿菌特異抗原 早期抗原靶6（ESAT-6） early secreted antigenic targe

19、t 6 培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10） culture filtrate protein 10 ）技 術(shù) 背 景第50頁，共134頁。結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子（IFN-）。因此，檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀。基于IGRA原理的檢測項目目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA）第51頁，共134頁。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技

20、術(shù)（ELISPOT）第52頁，共134頁。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）近二十多年來，隨著技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)是當(dāng)世公認(rèn)的最靈敏的抗原特定T細(xì)胞的體外檢測技術(shù)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA 技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測細(xì)胞因子的分泌情況，靈敏度高。其技術(shù)原理：用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色方式將其表現(xiàn)出來（Sedgwick JD 2005）。第53頁，共134頁。結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6與CFP10抗原由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)第

21、54頁，共134頁。操作步驟第55頁，共134頁。操作步驟孵育1小時第56頁，共134頁。實(shí) 際 效 果 圖陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10陽性對照（PHA）第57頁，共134頁。T-SPOT.TB 特點(diǎn)特異性好，不受卡介苗（BCG）接種和環(huán)境分枝桿菌影響靈敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高的檢出率快速，24小時報告結(jié)果第58頁，共134頁。寫入診療指南的國家（Guidelines）美國（CDC和兒科學(xué)會）；加拿大 （加拿大結(jié)核病委員會）；巴西（衛(wèi)生部）英國（國家衛(wèi)生和臨床協(xié)會）；法國（國家衛(wèi)生局）；西班牙（西班牙肺病和胸部手術(shù)協(xié)會）；德國（德國抗結(jié)核病中央

22、委員會）； 意大利；瑞士（瑞士肺科協(xié)會）；荷蘭（實(shí)用結(jié)核病控制委員會）；丹麥（丹麥肺部醫(yī)學(xué)會）；挪威（挪威公共衛(wèi)生協(xié)會）；芬蘭（國家衛(wèi)生和福利協(xié)會）；愛爾蘭（國家結(jié)核病咨詢委員會）；葡萄牙；捷克共和國； 斯洛伐克；波蘭；保加利亞；克羅地亞澳大利亞（國家結(jié)核病咨詢委員會、傳染病協(xié)會和澳大利亞風(fēng)濕病協(xié)會）；沙特阿拉伯；南朝鮮；日本（日本結(jié)核病預(yù)防協(xié)會） WHO和ECDC 中國（專家組推薦）第59頁，共134頁。1、結(jié)核病輔助診斷/療效評價“菌陰”結(jié)核病患者的輔助診斷肺外結(jié)核的鑒別診斷抗癆治療的療效評價2、免疫力低下/受抑制患者的結(jié)核診斷/感染篩查使用生物制劑/免疫抑制劑患者的結(jié)核感染篩查HIV感染

23、者/腎透析患者/器官移植患者3、兒童結(jié)核病的輔助診斷4、結(jié)核密切接觸者/高危人群的結(jié)核感染篩查結(jié)核病患者的家屬/醫(yī)務(wù)工作者/監(jiān)獄囚犯5、接觸追蹤臨床應(yīng)用第60頁，共134頁。結(jié)核相關(guān)疾病肺結(jié)核菌陽（痰涂片、痰培養(yǎng)）-結(jié)核?？漆t(yī)院菌陰-感染科、呼吸科、胸外科、結(jié)核科肺外結(jié)核淋巴結(jié)結(jié)核-外科、血液科、感染科結(jié)核性胸膜炎-感染科、呼吸科、結(jié)核科結(jié)核性腹膜炎-外科、消化科、感染科結(jié)核性腦膜炎-感染科、神經(jīng)科骨關(guān)節(jié)結(jié)核-骨科、風(fēng)濕科、感染科泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核-泌尿外科、腎臟科、感染科、性病科其他：如結(jié)核性心包炎、脾結(jié)核、胰腺結(jié)核等第61頁，共134頁。評 價不能夠提示臨床患者的病變部位不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的

24、多少來判斷受試者是活動性結(jié)核病患者或是潛伏感染者兒童結(jié)核的輔助診斷，需要結(jié)合臨床第62頁，共134頁。 (五)熒光抗體技術(shù)常用于呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等微生物抗原/抗體快速檢查。直接法、間接法。常用熒光染料：異硫氰酸熒光素（FITC）、四乙基羅丹明（RIB200）、藻紅蛋白（PE）、稀土鑭系元素等。第63頁，共134頁。 1.直接熒光抗體法熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。直接熒光抗體染色法示意圖 第64頁，共134頁。 病毒抗原檢測1.標(biāo)本收集和處理由專職護(hù)士將塑料導(dǎo)管經(jīng)鼻腔插入7-8cm達(dá)到咽部以下誘導(dǎo)吸取1-2ml分泌物,洗滌標(biāo)本，離心，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞濃度到1

25、.0106/ml。2.免疫熒光染色（Chemicon試劑）用直接免疫熒光試劑對所有標(biāo)本進(jìn)行檢測。熒光顯微鏡下觀察。檢測多種病毒：腺病毒（ADV）、流感病毒A(IFVA)、B型(IFVB)、副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)及呼吸道合胞病毒(RSV) 。標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室2h 內(nèi)就可得出結(jié)果,普通實(shí)驗(yàn)室即可開展，特異性達(dá)86%，敏感性達(dá)95%。 。第65頁，共134頁。特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。 間接熒光抗體染色法示意圖 2.間接熒光抗體法第66頁，共134頁。 (1)呼吸道病原體IgM抗體檢測西班牙Vircell生物公司生產(chǎn)的呼吸道感染病原體IgM九聯(lián)檢

26、測卡可早期、快速、準(zhǔn)確地檢出引起呼吸道感染的主要病原體的IgM抗體。 檢出的病原體包括：嗜肺軍團(tuán)菌血清型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、肺炎支原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒、型。第67頁，共134頁。九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑盒 第68頁，共134頁。 (2)載玻片結(jié)合抗原含有下列抗原：1. 嗜肺軍團(tuán)菌血清1型（懸浮于0.5%正常雞卵黃囊中以增強(qiáng)抗原吸附性和避免細(xì)菌聚集）2. McCoy細(xì)胞中的肺炎支原體3. Q熱立克次體II期（懸浮于0.5%正常雞卵黃囊中以增強(qiáng)抗原吸附性和避免細(xì)菌聚集）4. 肺炎衣原體（原生小體）5. HEp-2細(xì)胞

27、中的腺病毒6. HEp-2細(xì)胞中的呼吸道合胞病毒7. LLC-MK2細(xì)胞中的甲型流感病毒8. LLC-MK2細(xì)胞中的乙型流感病毒9. LLC-MK2細(xì)胞中副流感病毒1、2和3型10. 質(zhì)控孔。第69頁，共134頁。第70頁，共134頁。 （3）九聯(lián)檢的檢測價值特點(diǎn)：1.取材方便：空腹采集非抗凝靜脈血3ml。2.檢測全面：一卡九項，避免漏檢；3.靈敏度93.8%，特異性96.3%，性能穩(wěn)定，無交叉反應(yīng)；4.IgM抗體一般1-2周出現(xiàn)；2-3月消失。不能區(qū)分特別早期及重復(fù)感染。臨床意義： 呼吸道感染性疾病的早期、快速、準(zhǔn)確診斷； 對病原體的鑒別診斷提供導(dǎo)向性依據(jù)； 指導(dǎo)臨床合理用藥。 第71頁，共

28、134頁。第72頁，共134頁。第73頁，共134頁。（三）酶聯(lián)免疫技術(shù)1.GM試驗(yàn)：檢測人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖，用于侵襲性曲霉菌感染輔助診斷。2. 斑點(diǎn)ELISA技術(shù)：單克隆抗體結(jié)合硝酸纖維膜，檢測患者的咽拭標(biāo)本中肺炎支原體、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等病原體。第74頁，共134頁。 二、分子生物學(xué)技術(shù)第75頁，共134頁。分子診斷技術(shù)檢測致病菌PCR技術(shù)擴(kuò)增16srRNA基因鑒定常見致病菌革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌mecA基因VanA/VanB基因PBP2b基因PCR擴(kuò)增耐藥基因特異性基因ESBLs基因AmpC基因碳青霉烯酶基因mecA：耐甲氧西林葡萄球菌屬（MRS）

29、特異性基因Van A VanB ：耐萬古霉素腸球菌（VRA）特異性基因PBP2b ：青霉素不敏感肺炎鏈球菌（pNSSp）特異性基因ESBLs基因：主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXAAmpC基因包括質(zhì)粒介導(dǎo)型和染色體誘導(dǎo)型。其中前者主要包括MOX、CMY、DHA、ACC、ACT、FOX等亞型，后者主要包括： ADC。碳青霉烯酶基因：A類酶，以KPC為代表；金屬酶，以IMP、VIM、NDM為代表；D類酶，以O(shè)XA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-48為主。第76頁，共134頁。（一）DNA 分子中G+C 百分含量的測定遺傳物質(zhì)DNA中四種堿基G、C、A、T的排列和比例是DNA特性

30、的決定因素。細(xì)菌DNA G+C 或A+T mol%能反映細(xì)菌間DNA分子同源程度。不同種屬間G+C mol%范圍在25%-75%之間。同一種細(xì)菌G+C mol%相當(dāng)穩(wěn)定，不受菌齡、培養(yǎng)條件和其他外界因素影響,成為細(xì)菌分類和菌種鑒定的重要指標(biāo)。親緣關(guān)系越近的細(xì)菌G+C mol%越相近，但G+C mol%相同或近似，其親緣關(guān)系不一定相近。常用方法：熱變性溫度法、高效液相色譜法、浮力密度法和熒光法。第77頁，共134頁。 （二）DNA-DNA 雜交原理：基于DNA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的DNA在體外變性（高溫或pH)，并在合適的條件下(鹽類濃度和溫度），使互補(bǔ)的堿基重新配對，測量

31、雜交百分?jǐn)?shù)。常用方法：固相雜交法。將待測菌株雙鏈核酸解成單鏈固定在硝酸纖維素濾膜等固相支持物上，置入含有經(jīng)標(biāo)記的并解鏈的參照菌株的單鏈核酸(探針)液中復(fù)性，形成新的雙鏈核酸，測定雜合雙鏈的相對放射性強(qiáng)度來確定菌株間的同源性程度。同一菌：100%同源性。同一種內(nèi)同一亞種的細(xì)菌：80%-90%同源性。同一種內(nèi)不同亞種的細(xì)菌：60%-70%同源性。同一屬中的不同菌種的細(xì)菌： 20%-60%同源性。第78頁，共134頁。（三）核酸擴(kuò)增技術(shù)1985年發(fā)明PCR技術(shù)。常用檢測方法：逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、巢式PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機(jī)引物DNA多態(tài)性擴(kuò)增、限制性長度多態(tài)性分析

32、、實(shí)時熒光定量PCR等。目的基因包括16S rRNA、23S rRNA、16S-23S rRNA基因間隔區(qū)、熱休克蛋白基因、膜蛋白基因、DNA解旋酶B亞基的gyrB基因、細(xì)菌毒力基因等。16S rRNA、23S rRNA及16S-23S rRNA序列應(yīng)用最為廣泛。第79頁，共134頁。 1. 16S rDNA鑒定細(xì)菌的rRNA按沉降系數(shù)分可分為5S、16S和23S三種，其編碼基因(rDNA)的鏈長依次為120bp、1540bp和3300bp。20世紀(jì)60年代末，Woese等學(xué)者開始采用寡核苷酸編目法對生物進(jìn)行分類，通過比較各類生物細(xì)胞的rRNA特征序列，認(rèn)為16 s rRNA及其類似的rRNA

33、基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適。第80頁，共134頁。1. 16S rDNA鑒定16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它們相對穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)，其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū)，因此可設(shè)計群、屬、種特異性的探針。16S rDNA測序:細(xì)菌基因組DNA提取、16S rDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測序、序列比對等步驟。采用探針雜交或PCR等方法檢測血液、腦脊液等無菌體液中16S rRNA基因,即表明有細(xì)菌感染。16S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量較少，對于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌，其分辨率不高，16 S

34、 rDNA序列分析只能在屬的水平上區(qū)分細(xì)菌，仍然需要借助其他手段加以輔助分析。第81頁，共134頁。16S rRNA具有多拷貝多信息的特點(diǎn)第82頁，共134頁。2. 16s-23s rDNA鑒定16S-23S rDNA區(qū)間序列的進(jìn)化速度是16S rDNA的10倍。 16S、23S rDNA端序列高度保守?？捎糜诰N間的鑒別,還可以用來分辨16S rDNA不能鑒別的非常接近的菌種和種內(nèi)細(xì)菌之間的鑒別第83頁，共134頁。3. 核酸探針技術(shù) 原理：用帶有酶、化學(xué)熒光物、放射性核素或生物素標(biāo)記的已知序列特定DNA片段，稱為探針。在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則探針與待測標(biāo)本中的核酸雜交，通過對雜交信號的檢

35、測，從而鑒定標(biāo)本中有無相應(yīng)的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探針技術(shù)：液相雜交、固相雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交、Southern 印跡、Northern 印跡等。核酸探針可檢測任何特定病原微生物，目前已廣泛用于常見病毒感染的診斷和研究.第84頁，共134頁。4.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（1） LAMP技術(shù)來源：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。 1）2000年日本學(xué)者Notomi T等首先報道一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。 2）針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用1種鏈置換聚合酶，在恒溫條件(60-65)保溫約60min即可完

36、成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，還可通過設(shè)計兩條環(huán)引物可使反應(yīng)速度提升l/2l/3。 3）LAMP技術(shù)可用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原微生物的現(xiàn)場快速檢測、戰(zhàn)時野外、食品化妝品安全及基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用。第85頁，共134頁。（2）擴(kuò)增原理DNA在65左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2區(qū)段的3末端為起點(diǎn)，與模板DNA互補(bǔ)序列配對，啟動鏈置換DNA合成。第86頁，共134頁。第87頁，共134頁。第88頁，共134頁。（3）檢測方法熒光定量法：利用SYBR Green I熒光染料只與雙鏈DNA小溝

37、結(jié)合，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出較原先強(qiáng)8001 000倍的熒光的原理，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。獲取Ct值，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可確定模板DNA的起始拷貝數(shù)。顏色變化：產(chǎn)物中加SYBR Green I或Goldview，肉眼觀察顏色反應(yīng)；呈綠色的為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng) 。濁度檢測：在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg 結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀。肉眼觀察或濁度儀在400nm光下，檢測沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。 第89頁，共134頁。（4）LAMP試驗(yàn)缺陷與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳觀察等過程，具有簡便、快速、靈敏度高、特異

38、性強(qiáng)、低價等特點(diǎn)。缺點(diǎn)：1.引物設(shè)計比傳統(tǒng)的PCR復(fù)雜，為單鏈DNA的分離增加了難度。2.LAMP為定性試驗(yàn)，且只能檢測一種細(xì)菌，無法提供藥敏信息。3. 反應(yīng)的條件需要摸索：引物的長度與濃度、反應(yīng)條件、目的序列的大小、莖環(huán)結(jié)構(gòu)的大小等方面進(jìn)行優(yōu)化，提高擴(kuò)增效率和特異性。4. LAMP反應(yīng)易污染，最好分區(qū)操作。第90頁，共134頁。三、生物傳感器生物傳感器利用生物化學(xué)和電化學(xué)反應(yīng)原理，將生化反應(yīng)信號轉(zhuǎn)換為電信號，通過對電信號進(jìn)行放大和模數(shù)轉(zhuǎn)換，測量出被測物質(zhì)及其濃度。固定化的生物敏感材料作識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)）與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器（如氧電極、光敏管、

39、場效應(yīng)管、壓電晶體等等）及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。 由于生物傳感器檢測準(zhǔn)確、操作簡便、高度自動化、微型化與集成化的特點(diǎn)，近年來已經(jīng)在感染性疾病診斷、藥物篩選、生物武器監(jiān)測等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。檢測病原體的DNA生物傳感器最為常見，監(jiān)測多種細(xì)菌、病毒及其毒素，如炭疽芽胞桿菌、鼠疫耶爾森菌、埃博拉出血熱病毒、SARS病毒、肉毒桿菌類毒素等。 第91頁，共134頁。生物傳感器按所用分子識別元件的不同按信號轉(zhuǎn)換元件的不同按對輸出電信號的不同測量方式酶傳感器微生物傳感器組織傳感器細(xì)胞傳感器免疫傳感器DNA傳感器 電化學(xué)生物傳感器半導(dǎo)體生物傳感器測熱型生物傳感器測光型生物傳感器測聲型生物傳感器

40、電位型生物傳感器電流型生物傳感器伏安型生物傳感器第92頁，共134頁。微生物傳感器 微生物傳感器由固定化微生物、換能器和信號輸出裝置組成,利用固定化微生物代謝消耗溶液中的溶解氧或產(chǎn)生一些電活性物質(zhì)并放出光或熱的原理實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)的定量測定,原理見下圖：微生物傳感器原理示意圖第93頁，共134頁。Schematic diagram of BOD monitoring system for anaerobic wastewater treatment process第94頁，共134頁。影響傳感器響應(yīng)的因素1） PH值：微生物傳感器中細(xì)菌生長于轉(zhuǎn)換器電極要求的PH值不一致時，需要找出一個折衷值2）

41、緩沖溶液的種類和用量：Tris緩沖液可產(chǎn)生氨，而焦磷酸鹽緩沖液對微生物有抑制作用，這兩種緩沖液均不能用于用氨氣敏電極作為轉(zhuǎn)換器而組成的組氨酸微生物傳感器。另外緩沖劑的緩沖容量不足時也會造成電極不符合能斯特響應(yīng)。3） 微生物的用量：增加細(xì)菌細(xì)胞的用量可使能斯特響應(yīng)區(qū)增寬，但增加得太多又會導(dǎo)致響應(yīng)減慢，而且傳感器浸泡在緩沖液恢復(fù)到原來響應(yīng)值的時間也相應(yīng)增長。4） 溫度：微生物傳感器雖也要求最適溫度，但不像酶電極那樣敏感。適當(dāng)提高溫度可使細(xì)菌細(xì)胞新城代謝以及底物的擴(kuò)撒加快，從而使響應(yīng)時間縮短。5） 活化劑與穩(wěn)定劑6） 氣體的影響第95頁，共134頁。四、生物芯片生物芯片是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來

42、的一項技術(shù)。 以玻片、尼龍膜等為載體, 將大量基因片段、多肽、蛋白質(zhì)等探針分子固定于支持物上后與帶熒光標(biāo)記的DNA、蛋白質(zhì)或小分子等進(jìn)行雜交，檢測每個探針分子的雜交信號強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，從而實(shí)現(xiàn)對核酸、蛋白質(zhì)及其他生物成分的高通量快速檢測。病原微生物感染的快速診斷、變異及耐藥機(jī)制的研究；基因分型、分子流行病學(xué)調(diào)查和抗感染藥物的研制等。制備成本高，檢測儀器昂貴，特異性、敏感性有待進(jìn)一步提高等因素,目前還未在臨床病原微生物檢測中廣泛應(yīng)用。第96頁，共134頁。 生物芯片基本類型生物芯片biochip芯片實(shí)驗(yàn)室分析生物芯片DNA芯片蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片lab on chip

43、生物計算機(jī)芯片蛋白質(zhì)計算機(jī)芯片DNA計算機(jī)芯片biocomputeranalytical biochip第97頁，共134頁。五、質(zhì)譜分析技術(shù)質(zhì)譜法 (mass spectrometry, MS)：是在高真空系統(tǒng)中將樣品分子離解成帶電的離子，并通過對生成離子的質(zhì)量和強(qiáng)度的測定，而進(jìn)行樣品成分和結(jié)構(gòu)分析的方法。應(yīng)用：1. 適用于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，包括蛋白質(zhì)/肽質(zhì)量指紋譜測定，多肽序列分析等研究；2. 適用于臨床微生物快速準(zhǔn)確鑒定。第98頁，共134頁。研究者時間 貢獻(xiàn)J. J Thomson1912第一臺質(zhì)譜儀Gohlke and McLafferty1956氣相質(zhì)譜Biemann, Sei

44、bl et al.1959肽序列分析McLafferty, Jennings et al.1967串聯(lián)質(zhì)譜McLafferty1973液相質(zhì)譜Comisarow and Marshall1974傅立葉回旋共振質(zhì)譜Barber, Bordoli et al.1981快原子轟擊Yamashita, Fenn et al.1984電噴霧離子化用于生物大分子Tanaka, Karas et al.1988基質(zhì)輔助激光解吸離子化用于生物大分子質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展歷史簡介第99頁，共134頁。第100頁，共134頁。 MALDI-TOF MS技術(shù)1.不同屬種的細(xì)菌具有不同的蛋白指紋圖譜，根據(jù)細(xì)菌蛋白指紋圖譜可對細(xì)

45、菌進(jìn)行快速鑒定。 2.1996年，Claydon等采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）鑒定革蘭陰性和革蘭陽性細(xì)菌。 3. 激光照射樣品與基質(zhì)（-氰基-4-羥基肉桂酸，CHCA)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程是將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。離子在電場作用下加速飛過飛行管道到達(dá)檢測器，被測離子的飛行時間與離子的質(zhì)荷比與成正而達(dá)到檢測目的；再通過專用軟件分析比較，確定出病原菌特征性的指紋圖譜，質(zhì)量范圍為2-20KDa。每種微生物都有自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，因而擁有獨(dú)特的蛋白質(zhì)指紋圖譜。第101頁，共13

46、4頁。MALDI-TOF: 基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜分析法 (MS)VITEK MSMicroflex第102頁，共134頁。MALDI-TOF MS 概述(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight )解吸附離子化加速分離檢測離子檢測器+靶板基質(zhì)/樣本結(jié)晶加速場飛行時間第103頁，共134頁。MALDI-TOF MS: 基本原理標(biāo)本分子與基質(zhì)形成基質(zhì)/標(biāo)本結(jié)晶in vacuum 每個Bin的權(quán)重:+ : 高度菌種特異性(+15, +20.)+ : 中度菌種特異性(+3, +4.)- : 無峰(-3, -4.

47、)- : 無峰或者質(zhì)量峰對應(yīng)其他菌種(-15)第109頁，共134頁。VITEK MS 從質(zhì)量分布到Bin矩陣Peaks1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 . . 1298 1299 1300Bins1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S1 S2 S3S1 S2 S31 2 3 4 5 6 7 8 9 10 +Presence /Absence 第110頁，共134頁。Bin 1Bin 2Bin 3Bin 4Bin 5Bin 1300Abiotrophia defectiva00+4+150+4Acinetobacter haemolyticus0-3+40+40Acinetoba

48、cter johnsonii0-3000+4Acinetobacter junii00+40-30E. Coli+15-8+3000S.aureus0+200-15+4-3Salmonella group+13-11+40-20每一臺商品化VITEK MS 都使用Bin矩陣 每次數(shù)據(jù)庫更新都會對Bin矩陣進(jìn)行更新.ProbabilitycurvesVITEK MS Bin矩陣的發(fā)展 第111頁，共134頁。112同Bin矩陣比對為所有菌種計算bin值 (score)將Bin值轉(zhuǎn)換為置信度發(fā)送結(jié)果從譜圖獲取到結(jié)果報告的全自動化VITEK MS 結(jié)果計算第112頁，共134頁。VITEK MS (

49、IVD)基于種群SARAMIS (RUO)基于菌株Bruker BioTyper質(zhì)譜 不同的數(shù)據(jù)分析理念基于種群 菌種之間的差異得到了體現(xiàn)需要使用很多參考菌株基于單個菌株建庫快菌株并不可代表很多常見分離株第113頁，共134頁。標(biāo)本準(zhǔn)備的簡單步驟掃描標(biāo)本序列號掃描測試靶板 顯示空靶點(diǎn)將病原菌放在測試靶板上，并添加基質(zhì)掃描VITEK 2 藥敏卡VITEK MS: pending FDA clearance第114頁，共134頁。靈活性:多個操作臺(可達(dá)10個)盡可能單獨(dú)放置每批檢測可以分析1 4張靶板高通量:4 x 48 = 192 標(biāo)本/測試節(jié)省大量時間:無需進(jìn)行各種測試 多張芯片可以允許進(jìn)行

50、不同測試VITEK MS 簡化的操作流程Work Station 1Work Station 2Work Station 3Work Station 4VITEK MS: pending FDA clearance第115頁，共134頁。一次性測試靶板條形碼可溯源每個測試靶板有3個測試區(qū)每組1 16個樣本每個區(qū)域有校準(zhǔn)孔驗(yàn)證操作正確性(調(diào)整、對齊等)無需清洗VITEK MS 測試靶板第116頁，共134頁。產(chǎn)氣腸桿菌DSM 30053在三種不同培養(yǎng)基上生長24小時之后的譜圖所有樣本都具有主要特征峰所有培養(yǎng)基上的樣本都得到了正確鑒定 培養(yǎng)基對鑒定沒有影響對各種培養(yǎng)基兼容第117頁，共134頁。在哥倫比亞培養(yǎng)基上的奇異變形桿菌DSM 4479譜圖經(jīng)過120小時培養(yǎng)后，主要特征峰依然存在所有時間段樣本均得到了正確堅定培養(yǎng)時間不影響鑒定結(jié)果不同培養(yǎng)時間的鑒定結(jié)果第118頁，共134頁。1. 挑取克隆2. 涂在測試靶板上3. 加基質(zhì): 1 l 基質(zhì)(CHCA)-cyano-4-hydroxycinnamic acid(甲酸 酵