發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離

發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離第1頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二章發(fā)酵液的預(yù)處理與固液分離目的分離菌體和其他懸浮顆粒(細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物)；除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液性質(zhì)，以利于提取和精制的順利進(jìn)行。意義

從微生物發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中提取生化物質(zhì)的第一個(gè)必要步驟就是預(yù)處理和固液分離，他關(guān)系著下道工序的工藝設(shè)計(jì)。

第2頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離

掌握懸浮液的一般特征和預(yù)處理的方法，了解懸浮液的分離過(guò)程和分類(lèi)及常用的過(guò)濾法。

（一）、懸浮液的基本特征

（二）、懸浮液的預(yù)處理

（三）、懸浮液分離過(guò)程和分類(lèi)

（四）、過(guò)濾法

第3頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、發(fā)酵液的基本特征細(xì)菌及某些放線菌菌體細(xì)小，發(fā)酵液粘度大，不能直接過(guò)濾。由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其它有機(jī)粘性物質(zhì)的存在會(huì)造成濾液渾濁，濾速極慢。發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中對(duì)提煉影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+

）和雜蛋白質(zhì)等。第4頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、發(fā)酵液的預(yù)處理采用理化方法設(shè)法增大懸浮液中固體粒子的大小、或降低粘度，以利于過(guò)濾。去除會(huì)影響后續(xù)提取的高價(jià)無(wú)機(jī)離子和雜蛋白質(zhì)等。第5頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

預(yù)處理的方法1，高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法2，雜蛋白質(zhì)的去除3，發(fā)酵液的凝聚和絮凝第6頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法鈣離子，可用草酸，反應(yīng)生成的草酸鈣能促使蛋白質(zhì)凝固，提高濾液（也稱(chēng)為原液）質(zhì)量.鎂離子，可用三聚磷酸鈉它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物，用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。

Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na黃血鹽與鐵離子形成普魯土鹽沉淀

3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+第7頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2雜蛋白質(zhì)的去除方法熱變性沉淀大幅度改變pH加有機(jī)溶劑第8頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

雜蛋白質(zhì)的去除方法熱變性變性蛋白質(zhì)溶解度較小。最常用的使蛋白質(zhì)變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過(guò)濾速度。該法只適用于對(duì)熱較穩(wěn)定的生化物質(zhì)。第9頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

雜蛋白質(zhì)的去除方法沉淀蛋白質(zhì)在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱(chēng)為等電點(diǎn)。由于羧基的電離度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強(qiáng)于堿性，因而很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)（pH4.0－5.5）。在酸性溶液中,蛋白質(zhì)能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過(guò)氯酸鹽等形成沉淀。在堿性溶液中，能與一些陽(yáng)離子，如Ag，Ca2+、Mg2+、Fe3+和Pb等形成沉淀。第10頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

雜蛋白質(zhì)的去除方法大幅度改變pH在抗生素生產(chǎn)中，常將發(fā)酵液pH調(diào)至偏酸性范圍（pH2－3）或較堿性范圍（pH8一9）使蛋白質(zhì)凝固第11頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

雜蛋白質(zhì)的去除方法加有機(jī)溶劑加有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性的方法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。此外，還可以利用吸附作用除去蛋白質(zhì)。例如，四環(huán)類(lèi)抗生素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀[K2Zn3Fe（CN）5]

2的膠狀沉淀來(lái)吸附蛋白質(zhì)。第12頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3發(fā)酵液的凝聚和絮凝凝聚和絮凝技術(shù)能有效地改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來(lái)，增大體積，以便于過(guò)濾，常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。絮凝技術(shù)預(yù)處理發(fā)酵液的優(yōu)點(diǎn)不僅在于過(guò)濾速度的提高，還在于能有效地去除雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì)，如菌體、細(xì)胞和細(xì)胞碎片等，提高了濾液質(zhì)量第13頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3發(fā)酵液的凝聚和絮凝凝聚是在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程，是一種以物理的集合為主的過(guò)程。第14頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵液的凝聚原理通常發(fā)酵液中細(xì)胞或菌體帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒子（即正離子）被吸附在其周?chē)?，在界面上形成了雙電層。但是這些正離子還受到使它們均勻分布開(kāi)去的熱運(yùn)動(dòng)的影響，具有離開(kāi)膠粒表面的趨勢(shì)，在這兩種相反作用的影響下，雙電層就分裂成兩部分，第15頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵液的凝聚原理在相距膠核表面約一個(gè)離子半徑的平面以?xún)?nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面，稱(chēng)為吸附層或緊密層

在平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴(kuò)散開(kāi)去，距離越遠(yuǎn)，濃度越小，最后達(dá)到主體溶液的平均濃度，稱(chēng)為擴(kuò)散層。這樣就形成了擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型，如圖所示。第16頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第17頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三當(dāng)膠粒在溶液中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大，滑移（剪切面）在圖中用波紋線表示。

第18頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三這三種電位中只有ζ電位能實(shí)際測(cè)得，所以可以認(rèn)為它是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來(lái)表征雙電層的特征，并作為研究凝聚機(jī)理的重要參數(shù)。膠粒能保持分散狀態(tài)的原因主要是帶有相同電荷和擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)，一旦由于布朗（Brown）運(yùn)動(dòng)使粒子間距離縮小到它們的擴(kuò)散層部分重疊時(shí)，即產(chǎn)生使兩個(gè)粒子分開(kāi)的排斥力，從而阻止了粒子的聚集。ζ電位越大，電排斥作用就越強(qiáng)，膠粒的分散程度也越大，第19頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵液的凝聚原理此外，由于膠粒表面的水化作用，形成了包圍于粒子周?chē)乃瘜?，也能阻礙膠粒間的直接聚集。但是，水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起的，一旦ζ電位降低或消除，水化層也會(huì)隨之減弱或消失。第20頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵液的凝聚原理根據(jù)靜電學(xué)基本定理，可導(dǎo)出ζ電位的基本公式為：ζ＝4πqδ/D其中D—水的介電常數(shù)；q—膠體的電動(dòng)電荷密度，即滑移面上的電荷密度；δ—擴(kuò)散層的有效厚度可知，ζ電位與擴(kuò)散層厚度δ和電荷密度q成正比，而擴(kuò)散層厚度又與溶液中離子強(qiáng)度有關(guān)，當(dāng)雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間的范德華引力時(shí)，由于熱運(yùn)動(dòng)的結(jié)果導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集起來(lái)。第21頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

方法由此可見(jiàn)，在發(fā)酵液中加入具有高價(jià)陽(yáng)離子的電解質(zhì)，能降低ζ電位和脫除膠粒表面的水化膜，就能導(dǎo)致膠粒間的凝聚作用。常用的凝聚劑電解質(zhì)有Al2（SO4）3·18H2O（明礬）；AlC13·6H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。第22頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵液的絮凝原理絮凝作用有機(jī)高分子聚合物絮凝劑，它們具有長(zhǎng)鏈線狀的結(jié)構(gòu)，是一種水溶性的聚合物，分子量可高達(dá)數(shù)萬(wàn)至一千萬(wàn)以上，在長(zhǎng)的鏈節(jié)上含有相當(dāng)多的活性功能團(tuán)，可以帶有多價(jià)電荷（如陰離子或陽(yáng)離子），也可以不帶電性（如非離子型）。它們通過(guò)靜電引力、范德華分子引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面，一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生了架橋聯(lián)接，生成粗大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。第23頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

方法目前最常見(jiàn)的高分子聚合物絮凝劑是有機(jī)合成的聚丙烯酰胺類(lèi)衍生物。根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為非離子型、陰離子型（含有羧基）和陽(yáng)離子型（含有胺基）三類(lèi)。

聚丙烯酰胺類(lèi)絮凝劑具有用量少，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快以及種類(lèi)多等優(yōu)點(diǎn)，所以適用范圍廣。第24頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三它們的主要缺點(diǎn)是存在一定的毒性，特別是陽(yáng)離子型聚丙烯酰胺，要考慮這些物質(zhì)最終能否從產(chǎn)品中去除。近年來(lái)還發(fā)展了聚丙烯酸類(lèi)陰離子絮凝劑，它們無(wú)毒，可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中。還有聚苯乙烯類(lèi)衍生物及無(wú)機(jī)高分子聚合物絮凝劑，如聚合鋁鹽和聚合鋁鐵鹽等。除此以外，也可采用天然有機(jī)高分子絮凝劑。如多聚糖類(lèi)膠粘物，海藻酸鈉，明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等。第25頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

方法對(duì)于帶負(fù)電性菌體或蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，陽(yáng)離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低粒子排斥電位和產(chǎn)生吸附架橋的雙重機(jī)理，所以可以單獨(dú)使用。第26頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

方法對(duì)于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則主要通過(guò)分子間引力和氫鍵作用產(chǎn)生吸附架橋，它們常與無(wú)機(jī)電解質(zhì)凝聚劑搭配使用。首先加入無(wú)機(jī)電解質(zhì)，使懸浮粒子間的相互排斥能降低，脫穩(wěn)而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝劑。無(wú)機(jī)電解質(zhì)的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而，提高了絮凝效果。這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過(guò)程，常稱(chēng)為混凝。第27頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第28頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

影響絮凝的因素絮凝劑的添加量發(fā)酵液的pH絮凝劑的分子量攪拌轉(zhuǎn)速攪拌時(shí)間第29頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三絮凝劑加量對(duì)絮凝效果(濾速)的影響

料液中，絮凝劑濃度增加有助于架橋充分，但是過(guò)多的加量反而會(huì)引起吸附飽和，在每個(gè)膠粒上形成覆蓋層而使膠粒產(chǎn)生再次穩(wěn)定現(xiàn)象第30頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵液pH對(duì)陰離子聚丙烯酰胺絮凝效果的影響

溶液pH的變化常會(huì)影響離子型絮凝劑中功能團(tuán)的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。電離度增大，由于鏈節(jié)上相鄰離子基團(tuán)間的電排斥作用，而使分子鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，所以架橋能力提高。第31頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

二、發(fā)酵液的過(guò)濾微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細(xì)胞或細(xì)胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。過(guò)濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進(jìn)行分離的過(guò)程。在過(guò)濾操作中，要求濾速快，濾液澄清并且有高的收率。第32頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1、影響過(guò)濾速度的因素過(guò)濾速度和以下因素有關(guān)菌種。發(fā)酵條件。培養(yǎng)基的組成未用完的培養(yǎng)基消沫油發(fā)酵周期第33頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

菌種對(duì)過(guò)濾速度影響真菌的菌絲比較粗大，如青霉菌的菌絲直徑可達(dá)10μm，發(fā)酵液容易過(guò)濾，不需特殊處理。其濾渣呈緊密餅狀物，很容易從濾布上刮下來(lái)，故可采用鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾。放線菌發(fā)酵液菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀。如鏈霉素發(fā)酵液菌絲僅0.5~1.0μm左右，還含有很多多糖類(lèi)物質(zhì)，粘性強(qiáng)，過(guò)濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。細(xì)菌發(fā)酵液的菌體更細(xì)小，因此，過(guò)濾十分因準(zhǔn)，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過(guò)濾的設(shè)備來(lái)完成過(guò)濾操作。第34頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)基的組成對(duì)過(guò)濾速度影響用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會(huì)使過(guò)濾困難；發(fā)酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培養(yǎng)基也會(huì)使過(guò)濾困難。第35頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三發(fā)酵周期對(duì)過(guò)濾的影響

正確選擇發(fā)酵終了時(shí)間對(duì)過(guò)濾影響很大。在菌體絲自溶前必須放罐，因?yàn)榧?xì)胞自治后的分解產(chǎn)物一股很難過(guò)濾。有時(shí)延長(zhǎng)發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴(yán)重影響發(fā)酵液質(zhì)量，使色素和膠狀雜質(zhì)增多、過(guò)濾困難，最終造成成品質(zhì)量降低。第36頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2、改善過(guò)濾性能的方法等電點(diǎn)蛋白質(zhì)變性吸附凝聚和絮凝加入助濾劑直接在發(fā)酵液中形成填充-凝固劑酶解作用第37頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

過(guò)濾助劑助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。過(guò)濾助劑可解決兩個(gè)問(wèn)題濾餅的可壓縮性問(wèn)題小粒子如菌絲碎片和細(xì)菌細(xì)胞，會(huì)滲入到轉(zhuǎn)鼓真空過(guò)濾預(yù)覆蓋層內(nèi)部。使得預(yù)覆蓋層的部分孔被堵塞，影響了滲透性。加入助濾劑可以解決這一問(wèn)題常用的過(guò)濾助劑硅藻土、珍珠巖、磨碎的木漿、淀粉第38頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三助濾劑的加入有兩種方法：在濾布上預(yù)先鋪一層助濾劑(1~2mm)，該方法，會(huì)使濾速降低，但濾液透明度直接加入發(fā)酵液中（助濾劑的用量，有一條經(jīng)驗(yàn)規(guī)則可供參考，即助濾劑用量若等于懸浮液中固體含量時(shí)，濾速最快。）第39頁(yè)，共44頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

填充-凝固劑改善過(guò)濾性能較好的方法是加入一些反應(yīng)劑，它們能相互作用，或和某些溶解性鹽類(lèi)發(fā)生反應(yīng)生成不溶解的沉淀(CaSO4，AlPO4等)。生成