乙?；揎椂康鞍踪|(zhì)組學(xué)含案例

主要內(nèi)容乙酰化修飾非標(biāo)定量技術(shù)簡介乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)原理乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)優(yōu)勢乙酰化修飾實(shí)驗(yàn)流程乙?；揎棇?shí)驗(yàn)結(jié)果示例乙?；揎棇?shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟經(jīng)典案例現(xiàn)在是1頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)簡介

蛋白質(zhì)的乙?；揎検窃谝阴；D(zhuǎn)移酶的作用下，蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上添加乙?；倪^程，是細(xì)胞控制基因表達(dá)、蛋白質(zhì)的活性或生理過程的一種機(jī)制。

最近的調(diào)查表明，蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基的乙酰化普遍存在于人體的代謝酶之中，具有調(diào)節(jié)代謝通路及代謝酶的活性。乙酰化是一個(gè)普遍和重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，主要集中在對細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)的影響以及對核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活方面

，還影響參與細(xì)胞周期和新陳代謝、肌動(dòng)蛋白聚合控制，蛋白的乙?；癄顟B(tài)調(diào)節(jié)受損的癌癥和多聚谷氨酰胺疾病。蛋白質(zhì)的乙酰化具有很高的功能特異性，與腫瘤等等疾病密切相關(guān)，也是目前正在開發(fā)的抗癌藥物的靶點(diǎn)。通過高通量的蛋白質(zhì)組研究和不同物種的代謝通路研究發(fā)現(xiàn)，在生理狀況下，存在著大量非細(xì)胞核的蛋白質(zhì)被乙酰化修飾，具有廣泛的生物學(xué)意義?，F(xiàn)在是2頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)原理技術(shù)原理

賴氨酸發(fā)生乙?；牡鞍讓Ω鞣N生物功能進(jìn)行調(diào)控。實(shí)驗(yàn)基于特異性識(shí)別乙酰化賴氨酸殘基的乙?；贵w，對含有乙酰化修飾的賴氨酸肽段進(jìn)行富集。乙?；蟮碾亩危|(zhì)量發(fā)生42Da的質(zhì)量變化，基于非標(biāo)定量的質(zhì)譜方法對乙?；亩芜M(jìn)行鑒定。

如：組蛋白乙?；喟l(fā)生在核心組蛋白N一端堿性氨基酸集中區(qū)的特定賴氨酸殘基，將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到賴氨酸的sNH3+中和掉1個(gè)正電荷。組蛋白乙?；绞怯山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone

acetyltmnsferse，HATs)和組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(histone

deacetylase，HDACs)共同決定。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙?；c組蛋白去乙酰化過程處于動(dòng)態(tài)平衡，精確地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)?，F(xiàn)在是3頁\一共有24頁\編輯于星期二乙酰化修飾非標(biāo)定量技術(shù)優(yōu)勢乙?；贵w：特異性識(shí)別乙?；嚢彼釟埢痪珳?zhǔn)鎖定目標(biāo)范圍。靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；分離能力強(qiáng):可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等；適用范圍廣：可以對任何類型的蛋白質(zhì)乙?；M(jìn)行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：不受樣本數(shù)據(jù)限制，特別適用于采用多種處理方式或來自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析；結(jié)果可靠：定性與定量同步進(jìn)行，同時(shí)給出每一個(gè)組分的相對表達(dá)水平、分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；自動(dòng)化程度高：液質(zhì)聯(lián)用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好?，F(xiàn)在是4頁\一共有24頁\編輯于星期二乙酰化修飾實(shí)驗(yàn)流程乙?；揎棇?shí)驗(yàn)流程。

1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質(zhì)；

2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切；

3：各組樣本肽段進(jìn)行純化；

4：各組樣本的肽段分別用乙?；贵w試劑進(jìn)行富集，并RP分離餾分；

5：Q-Exactive質(zhì)譜檢測，定性及定量分析；6：流程化生物信息分析及個(gè)性化設(shè)計(jì)生物信息服務(wù)蛋白質(zhì)樣品制備樣品及實(shí)驗(yàn)預(yù)判酶解乙酰化抗體富集RP分解質(zhì)譜分析軟件分析定性定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)、生物信息分析現(xiàn)在是5頁\一共有24頁\編輯于星期二乙酰化修飾實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例小鼠的肌肉樣本：乙?；揎棇?shí)驗(yàn)（4例樣本：A、B、C、D）1:提取各組蛋白質(zhì)，定量并用胰酶酶切；2.各組肽段純化，并用乙?；揎椏贵w進(jìn)行富集；3.

RP分離和質(zhì)譜分析.

4:不同樣本中乙?；揎椀牟町惐磉_(dá)可通過二級質(zhì)譜中峰面積確定5.根據(jù)該肽段的二級質(zhì)譜峰圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，得到蛋白的定性及定量信息。質(zhì)譜掃描完畢，得到質(zhì)譜信號(hào)總圖橫坐標(biāo)是洗脫時(shí)間，縱坐標(biāo)是信號(hào)強(qiáng)度?，F(xiàn)在是6頁\一共有24頁\編輯于星期二乙酰化修飾實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例4例樣本共鑒定到1449個(gè)蛋白，肽段6879個(gè)，乙酰化修飾肽段637個(gè)。乙酰化修飾的差異分析如下：兩兩比較顯著差異B/A189C/B202D/C248C/A243D/A273現(xiàn)在是7頁\一共有24頁\編輯于星期二鑒定到的蛋白列表-結(jié)果現(xiàn)在是8頁\一共有24頁\編輯于星期二鑒定到的肽段列表-結(jié)果現(xiàn)在是9頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；揎棇?shí)驗(yàn)結(jié)果示例

生物信息數(shù)據(jù)交蓋圖

原始數(shù)據(jù)表達(dá)量圖現(xiàn)在是10頁\一共有24頁\編輯于星期二表達(dá)量分布圖

箱線圖現(xiàn)在是11頁\一共有24頁\編輯于星期二GO富集分析現(xiàn)在是12頁\一共有24頁\編輯于星期二Pathway通路富集分析現(xiàn)在是13頁\一共有24頁\編輯于星期二高階（客制化）信息分析詳見信息分析PDF現(xiàn)在是14頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟1：蛋白質(zhì)提取

提供專業(yè)的樣本制備，與后期翻譯后修飾富集、液相、質(zhì)譜完美對接。注意事項(xiàng)：1、樣本不要反復(fù)凍融。收集后立即放于液氮中或-80°冰箱保存。2、原始樣本濕重大于1g，根據(jù)不同樣本得率情況盡量多提供原始樣本。3、提得的蛋白大于5mg，可完成一次正常富集。若樣本珍貴難獲取，最少2mg可完成一次實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)在是15頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟2：蛋白質(zhì)定量

(1)可以采用Bradford方法及其他方法定量初步

(2)定量取各組樣本的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS電泳，考染定量，根據(jù)每個(gè)涌道染色情況微調(diào)蛋白濃度，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中每組樣本的蛋白量相同?，F(xiàn)在是16頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟3：酶切，富集每組樣本（各5mg）分別加入-20℃預(yù)冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20℃沉淀30min~4h12000rpm離心15分鐘，棄上清，用lysisbuffer充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2μL，混勻，60℃反應(yīng)1h；加入半胱氨酸封閉試劑1μL,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質(zhì)=1：100的比例加入trypsin酶,37℃酶解過夜（16h）；收集肽段，純化，真空冷凍干燥。乙?；贵w富集RP分離質(zhì)譜檢測現(xiàn)在是17頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟4：除鹽，此步操作是將實(shí)驗(yàn)過程和相關(guān)buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。（1）100%乙腈沖洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上（4）0.1%TFA沖洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脫下樣品（6）將樣品冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)分析?，F(xiàn)在是18頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟5:RP液相分離或手動(dòng)RP（1）儀器及試劑：渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：QL-901）離心機(jī)（Thermo，型號(hào)：PICO17）RIGOLL-3000高效液相色譜系統(tǒng)（北京普源精電科技有限公司）色譜柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，100?（Agela，貨號(hào)：DC952505-0）乙腈（Merck，貨號(hào)：100030，德國）氨水（Sigma-Aldrich，貨號(hào)：17837，美國）流動(dòng)相A：98%ddH2O，2%乙腈（pH10）-流動(dòng)相B：98%乙腈，2%ddH2O（pH10）ddH2O用氨水調(diào)pH值到10

現(xiàn)在是19頁\一共有24頁\編輯于星期二（2）樣品用100ul流動(dòng)相A溶解，14000g離心20min，取上清待用。

（3）使用酶解好的BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離測試（柱溫45℃，檢測波長214nm），檢測系統(tǒng)情況。取100ul準(zhǔn)備好的樣本上樣。

流速0.7ml/min，分離梯度如右圖所示：（4）根據(jù)峰型和時(shí)間共收取梯度,根據(jù)規(guī)則合并，真空離心濃縮后，待質(zhì)譜分析。質(zhì)譜鑒定：MS掃描范圍400-1800MS/MS掃描范圍100-2000時(shí)間（分鐘）流動(dòng)相B比例（%）05583518623264956895725現(xiàn)在是20頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；揎椩敿?xì)實(shí)驗(yàn)步驟6:納升級反相色譜-QExactive進(jìn)行蛋白質(zhì)分析（1）儀器及試劑：渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：QL-901）離心機(jī)（Thermo，型號(hào)：PICO17）高效液相色譜儀：（ThermoScienticEASY-nLC1000System（NanoHPLC））質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo，型號(hào)：Q-Exactive）

流動(dòng)相A：100%超純水，0.1%甲酸流動(dòng)相B：100%乙腈，0.1%甲酸甲酸：（Sigma-Aldrich，貨號(hào)：56302，美國）甲醇：（Sigma-Aldrich，貨號(hào)：14262，美國）預(yù)柱（AcclaimPepMap100column，2cmx100μm，C18，5μm）色譜柱（EASY-Spraycolumn，12cmx75μm，C18，3μm）進(jìn)樣瓶（Thermo，11190533）瓶蓋（Thermo，11150635）噴針（Thermo，PN：ES542）現(xiàn)在是21頁\一共有24頁\編輯于星期二

（2）具體操作參數(shù)

時(shí)間（分鐘）流動(dòng)相B比例（%）045154025653570958295854904將高pH反相分離得到的組份用20μl2%甲醇，0.1%甲酸復(fù)溶。12,000轉(zhuǎn)離心10分鐘，吸取上清上樣。上樣體積10μl，采取夾心法上樣。LoadingPump流速350nl/min，15分鐘。分離流速350nl/min，分離梯度如下：現(xiàn)在是22頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟7:

數(shù)據(jù)檢索乙?；菢?biāo)定量的質(zhì)譜分析是由ThermoQ-Exactive型質(zhì)譜完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用MaxQuant軟件處理。檢索參數(shù)設(shè)置如下：參數(shù)名稱實(shí)驗(yàn)選項(xiàng)FixedmodificationCarbamidomethyl(C)VariablemodificationOxidation（M），Acetyl（K），Acetyl（N-term）peptidetol.15ppmMS/MStol20mmuMaxmissedcleavages2InstrumentQ_ExactiveEnzymeTrypsinDatabaseuniport_現(xiàn)在是23頁\一共有24頁\編輯于星期二乙?；揎椊?jīng)典案例案例：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：