從生物樣品中分離純化生物大分子

醫(yī)學生物學

設(shè)計探索實驗現(xiàn)在是1頁\一共有26頁\編輯于星期四從生物樣品中分離純化生物大分子從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶2現(xiàn)在是2頁\一共有26頁\編輯于星期四從生物樣品中分離純化生物大分子3現(xiàn)在是3頁\一共有26頁\編輯于星期四生物大分子生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達到上萬或更多的有機分子。常見的生物大分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。實際上生物大分子的特點在于其表現(xiàn)出的各種生物活性和在生物新陳代謝中的作用。

生物大分子大多數(shù)是由簡單的組成結(jié)構(gòu)聚合而成的，例如蛋白質(zhì)的組成單位是氨基酸，核酸的組成單位是核苷酸等從生物樣品中分離純化生物大分子——背景知識根據(jù)不同生物大分子的特性制定不同的實驗條件4現(xiàn)在是4頁\一共有26頁\編輯于星期四生物大分子分離純化的特殊性從生物樣品中分離純化生物大分子——背景知識⑴生物材料的組成極其復(fù)雜，有數(shù)百種至幾千種化合物。⑵生物大分子的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。⑶生物大分子離開了生物體內(nèi)的環(huán)境極易失活，因此如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷。

生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作。5現(xiàn)在是5頁\一共有26頁\編輯于星期四前期準備細胞破碎分離純化提取鑒定濃縮、干燥、保存從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線6現(xiàn)在是6頁\一共有26頁\編輯于星期四從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線1.確定要分離提純的生物大分子的目的和要求2.建立相應(yīng)可靠的分析測定方法3.查閱文獻調(diào)研和預(yù)備性實驗前期準備7現(xiàn)在是7頁\一共有26頁\編輯于星期四前期準備細胞破碎分離純化提取鑒定濃縮、干燥、保存從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線8現(xiàn)在是8頁\一共有26頁\編輯于星期四細胞破碎機械破碎化學破碎物理破碎酶學破碎從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線9現(xiàn)在是9頁\一共有26頁\編輯于星期四前期準備細胞破碎分離純化提取鑒定濃縮、干燥、保存從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線10現(xiàn)在是10頁\一共有26頁\編輯于星期四11分離純化從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線同樣的一類物質(zhì)往往有很多種方案可以進行分離提純，但如何根據(jù)所需生物大分子的種類、它所處的生物環(huán)境、客觀因素等種種條件來選擇最好的一種分離純化方式，是整個實驗最為困難的步驟。而在一些尖端領(lǐng)域，甚至需要研究人員自行探索新的方案，這無疑又大大加大了這一步的難度。所以可以說，這一步是整個實驗過程中最為困難的一步，也應(yīng)是投入精力最多、選擇最仔細的一步。11現(xiàn)在是11頁\一共有26頁\編輯于星期四前期準備細胞破碎分離純化提取鑒定濃縮、干燥、保存從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線12現(xiàn)在是12頁\一共有26頁\編輯于星期四提取鑒定從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線根據(jù)提純的生物大分子種類不同，選用相應(yīng)的檢測方式進行檢測。物理、化學方法：比色法、氣相/液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。但應(yīng)注意，如果實驗對精確性要求較高則必須同時采用2-3種不同的純度鑒定法才能確定。生物學的測定法：酶活測定、蛋白質(zhì)含量測定、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等；

實驗需要了解的理化性質(zhì)

在水和各種有機溶劑中的溶解性。在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。固態(tài)時和凍干時的穩(wěn)定性。

物理性質(zhì)：分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)等。

化學性質(zhì)：對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學試劑的穩(wěn)定性。對其他生物分子的特殊親和力等。離子交換柱層析法電泳法電荷性質(zhì)的差異分子大小形狀差異凝膠過濾法超濾法透析法離心法溶解度差異分配層析萃取結(jié)晶鹽析有機溶劑沉淀選擇性沉淀沉淀法生物功能專一性親和層析13現(xiàn)在是13頁\一共有26頁\編輯于星期四前期準備細胞破碎分離純化提取鑒定濃縮、干燥、保存從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線14現(xiàn)在是14頁\一共有26頁\編輯于星期四濃縮、干燥、保存從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線濃縮：從低濃度的溶液中除去水或溶劑使之變?yōu)楦邼舛鹊娜芤旱倪^程。干燥：把潮濕的固體、膏狀物、濃縮液及液體中的水或溶劑除盡的過程。干粉保存：0-4℃冰箱中保存即可（樣品置于干燥器中）。液態(tài)保存：0-4℃冰箱即可。不能放在0℃以下，因為結(jié)冰會使大分子構(gòu)象破壞，使其失活。15現(xiàn)在是15頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委分離純化細胞破碎提取鑒定前期準備濃縮、干燥、保存完成內(nèi)容從生物樣品中分離純化生物大分子——技術(shù)路線16現(xiàn)在是16頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從生物樣品中分離純化生物大分子——常見生物大分子分離純化分離純化原則：

保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。具體原則：溫度不要過高；控制pH值范圍(pH值5-9);保持一定離子強度;減少物理因素對核酸的機械剪切力。

防止核酸生物降解

DNA酶抑制劑：金屬離子螯合劑；陰離子型表面活性劑

RNA酶抑制劑：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸鹽)；肝素；復(fù)合硅酸鹽；RNase阻抑蛋白；氧釩核糖核苷復(fù)合物

②分離純化的步驟：

取材：核酸在細胞內(nèi)部，所以需要破碎細胞才能取得核酸，常用方法如下：高速組織搗碎機搗碎；玻璃勻漿器勻漿；超聲波處理法；液氮研磨法；化學處理法(SDS、LDS，吐溫80等）；生化法（溶菌酶、纖維素酶等）核酸的分離純化

除雜：

肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數(shù)天然后殺死；加入淀粉酶；在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA。

蛋白質(zhì)的除去：加入去污劑如SDS；氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提；苯酚水溶液抽提；加入濃鹽溶液如NaCl。

不同類型核酸的分離：（1）從DNA中除去RNA：核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA；鈣鹽分步沉淀；活性炭吸附。（2）從RNA中除去DNA：苯酚水溶液抽提；加入脫氧核糖核酸酶處理。

同類核酸的分離：（1）RNA混合物的分離：多應(yīng)用柱層析、梯度離心及逆流分溶等方法。（2）DNA混合物的分離：常用磷酸鈣、ECTEOLA-纖維素、DEAE-纖維素和甲基化白蛋白柱層析，逆流分溶，梯度離心等方法。

濃縮：常用沉淀的方法。其好處是：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。常用方法如下：

鹽溶液沉淀：如MgCl2；NaAc；KAc等。

有機溶劑沉淀：如乙醇；異丙醇；聚乙二醇（PEG）；精胺等。低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求。

測定：一般選用紫外分光光度法或溴乙錠熒光法測定核酸的含量。

保存：對DNA和RNA有不同的保存方式：

對DNA：DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；長期保存樣品中可加入1滴氯仿。對RNA：RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存；長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2mol/L氧釩核糖核苷復(fù)合物凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。17現(xiàn)在是17頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從生物樣品中分離純化生物大分子——常見生物大分子分離純化脂質(zhì)的分離純化

注意：組織破碎的方法會影響提取的脂質(zhì)的濃度，因此分析的時候必須將各種破碎方法進行比較。

操作方法：按照Folchmethod法進行操作：

先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取組織按1：20的量和氯仿/甲醇一起組織均漿，分層后在室溫下在搖床中搖動15-20分鐘。均漿通過濾紙過濾或者離心獲得液體。在離心獲得的液體中加入0.2倍體積的水或者0.9%的生理鹽水，渦旋幾秒鐘混均，然后2000rpm離心得到兩相溶液，如果需要的話用甲醇/水（1/1）的將兩相界面洗一到兩次，洗的過程不要讓甲醇/水與下層混合。通過離心和虹吸去掉上層后，下層氯仿相含有脂質(zhì)，如果體積在2-3ml以下則通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或在氮氣下濃縮。二氯甲烷可以替代氯仿，結(jié)果表明二氯甲烷/甲醇能夠取代氯仿/甲醇，因此能夠避免氯仿帶來的健康、安全和管理問題。18現(xiàn)在是18頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從生物樣品中分離純化生物大分子——常見生物大分子分離純化

單、雙糖：常見的單、雙糖一般采用合成的方式。制備如下：脫脂→去雜→濃縮→再次去雜→脫色→濃縮→冷卻→結(jié)晶（→進一步純化）。

多糖的分離純化：

脫脂：由于多糖被脂質(zhì)包圍，通常用醇或醚回流脫脂。

提?。?/p>

熱水浸提法微波輔助提取法超聲輔助法索氏提取法醇提法其它方法（如稀堿液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等）糖類的分離純化

除雜：

除蛋白質(zhì)：沙維積法（Sevag法）；三氟三氯乙烷法；三氯醋酸法；酶解法；鹽酸法；其它方法（如加入5%ZnSO4溶液和飽和Ba（OH）2溶液，振蕩后離心去蛋白，但此方法不夠徹底）。

除色素：活性炭除色素；弱堿性樹脂DEAE纖維素或DuoliteA－7來吸附色素（針對植物色素）；氧化脫色（糖和色素時結(jié)合，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫的）；依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖；用4:1的氯仿-正丁醇除色素

除低聚糖等小分子雜質(zhì)：逆向流水透析法。

純化：分部沉淀法、鹽析法、季銨鹽沉淀法、制備性區(qū)域電泳膜分離法、金屬絡(luò)合物法其它方法（如超過濾法、活性炭柱色譜、LKB柱色譜系統(tǒng)等）

純度鑒定：多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分.多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HLPC法等.現(xiàn)在應(yīng)用較多的是HLPC法，旋光度測定也是純度測定的一種方法。

分子量的測定：多糖分子量的測定是研究多糖性質(zhì)的一項重要工作.常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法、MALDI－TOF－MS法.

結(jié)構(gòu)測定：多糖一級結(jié)構(gòu)測定：多糖的一級結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目、連接方式及苷建構(gòu)型.常用化學法和儀器分析法。多糖高級結(jié)構(gòu)測定：目前研究多糖的二級結(jié)構(gòu)常用的手段是NMR技術(shù)。近年來，以精確三維結(jié)構(gòu)知識為基礎(chǔ)揭示重要生命活動的規(guī)律已達到前所未有的深度和廣度。19現(xiàn)在是19頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從生物樣品中分離純化生物大分子——常見生物大分子分離純化基本原理：一是利用混合物中幾個組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個或幾個相中，如鹽析、有機溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心。純化蛋白質(zhì)大分子涉及純度和產(chǎn)率實際中兩者不能兼得，視目的而取舍。蛋白質(zhì)的分離純化（2）前處理：

定義：把蛋白質(zhì)從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。選擇適當?shù)姆椒?，破碎組織和細胞：

動物組織和細胞：用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理法破碎；

植物組織和細胞：使用石英砂和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理。

細菌細胞：常用方法有超聲波振蕩，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。如果蛋白質(zhì)主要集中在某一亞細胞，例如細胞核、染色體、核糖體或可溶性的細胞漿等。用差速離心方法分離，收集亞細胞組分材料。如果蛋白質(zhì)是與細胞膜或膜質(zhì)細胞器結(jié)合，必須用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚。（3）粗分級：

定義：選用一套適當方法，把蛋白質(zhì)混合物提取液中，所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開來。

方法：鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。（4）細分級：

定義：樣品的進一步提純。

方法：

層析法：凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。

電泳法：包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等（5）進一步分離純化

沉淀法：根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同，將目的蛋白質(zhì)大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。包括：鹽析、有機溶劑沉淀、結(jié)晶、等電點沉淀、選擇性沉淀等（6）濃縮：

減壓加溫蒸發(fā)濃縮空氣流動蒸發(fā)濃縮冰凍法吸收法超濾法（7）干燥與保存：真空干燥：適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低溫0－4度，其活性在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化。20現(xiàn)在是20頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶實驗流程取動物肝組織制作組織漿液肝酶的粗提取肝酶的純化鑒定肝酶純度21現(xiàn)在是21頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶梯度離心選取新鮮的，饑餓24小時的動物的肝臟，生理鹽水多次洗滌，低溫保存。取動物肝組織取新鮮動物肝臟低溫下剪碎，放進培養(yǎng)皿中，移入勻漿器中，過濾。離心管中加入5ml0.34M蔗糖，將5ml勻漿輕覆在其上1600r/min離心10min上清液1沉淀10ml0.25M蔗糖混勻3500r/min離心10min上清液2沉淀混合取1ml6600r/min離心10min上清液3（即為酶體和微粒體）22現(xiàn)在是22頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶肝酶的粗提取等電點沉淀法實驗原理

利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，及不同兩性電解質(zhì)的等電點不同這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法。在溶液的pH值等于溶液中某兩性電解質(zhì)的等電點時，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下來。因此可以通過調(diào)節(jié)介質(zhì)的pH，把目的酶和雜蛋白分開。

但由于蛋白質(zhì)在pI點附近一定范圍的pH內(nèi)都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，而且相當多的蛋白質(zhì)的pI點很靠近，所以該法的回收率和純化倍數(shù)都不理想，一般只用于酶的粗分離階段。選用適當?shù)木彌_液（CH3COONH4，或NaH2PO3-Na2HPO3），調(diào)節(jié)pH＝６.２，將目的物以沉淀狀態(tài)分離，再重新溶于適當?shù)木彌_液，以供進一步純化。實驗步驟23現(xiàn)在是23頁\一共有26頁\編輯于星期四比賽評委從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶肝酶的純化離子交換柱層析混合物在經(jīng)過固定相和流動相的過程中，不斷地進行交換、分配、吸附及解吸附等過程，由于其中各組分間在理化性質(zhì)上存在著差異，因此當它們經(jīng)過上述相同重復(fù)過程時，各自的情況就會有所不同，從而使各物質(zhì)得以分離。離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE—纖維素），當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。實驗原理①DEAE-纖維素處理為PH=6.3（HCl）②裝柱與平衡（乙酸銨溶液）③樣品上樣、乙酸銨溶液洗脫收