微生物教程yyd微生物的遺傳變異和育種

微生物教程yyd微生物的遺傳變異和育種第1頁/共94頁第八章微生物的遺傳變異和育種第2頁/共94頁第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎第二節(jié)基因突變和誘變育種第三節(jié)基因重組第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種的衰退、復壯和保藏第3頁/共94頁

第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎

一、三個經(jīng)典實驗

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化試驗

F．Griffith（1928年）

肺炎雙球菌，可使人患肺炎，也可使小白鼠患敗血癥而死亡。它有多種菌株，其中具有莢膜，且菌落表面光滑（smoth）的致病菌株,稱S型;另一種不形成莢膜,菌落粗糙（rough）,無致病性,稱R型。

F．Griffith作了3組實驗如下圖第4頁/共94頁第5頁/共94頁第6頁/共94頁第7頁/共94頁

后來，有三位科學家將第三組實驗進行如下改進：從高溫滅活的S型細菌中提取幾種細胞成分(如DNA、蛋白質(zhì)、莢膜多糖等)分別進行轉(zhuǎn)化實驗

——Avery實驗，如圖示：

以上實驗說明：高溫滅活的S型肺炎球菌的細胞內(nèi)存在一種物質(zhì)，能以某種方式進入R型細胞使其表達出莢膜性狀。其中Avery實驗進一步證明轉(zhuǎn)化因子是DNA。第8頁/共94頁（二）噬菌體感染試驗

1952年，A.D.Hershey和M.Chase將E.coli分別培養(yǎng)在以放射性32PO43-或35SO42-作為磷源或硫源的組合培養(yǎng)基中，得到兩種噬菌體:一種含32P-DNA為核心的噬菌體，一種含35S-蛋白質(zhì)外殼的噬菌體。實驗如下圖第9頁/共94頁噬菌體感染實驗Pr只含S不含PDNA只含P不含S原理步驟1：用含同位素Ｓ35,

P32的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌2：讓T2感染上述大腸桿菌使其打是S35P32標記3：吸附10分鐘后攪動離心上清液沉淀結果：上清液中含15%放射擊性；沉淀中含85%放射性第10頁/共94頁（三）植物病毒的重建試驗

煙草花葉病毒（TMV）是一種只含RNA的植物病毒，其中94%是蛋白質(zhì)外殼，6%是RNA?？稍跓煵萆弦鸩“?。把TMV放在水和苯酚中震蕩，可將病毒的蛋白質(zhì)外殼和RNA分開，分開的蛋白質(zhì)外殼和RNA分子又能重新組合成具有感染力的完整病毒粒子。另一株與TMV近緣的霍氏車前花葉病毒（HRV），也可引起病斑。但兩種病斑的表征不同。

1956年，F(xiàn)raenkel-conrat利用這兩株植物病毒的核酸和蛋白質(zhì)的拆、合及相互對換進行實驗如下圖。第11頁/共94頁植物病毒的重建實驗TMVHRVHRVTMV原始株拆開重建感染分離純化

第12頁/共94頁第13頁/共94頁（一）七個水平細胞水平細胞核水平染色體水平核酸水平基因水平密碼子水平核苷酸水平二、遺傳物質(zhì)存在的部位和方式第14頁/共94頁質(zhì)粒：凡游離于原核生物核基因組以外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀的dsDNA分子。質(zhì)粒特點：從結構上看為超螺旋結構從大小上看，相對分子質(zhì)量為106～108（相當核基因組的1％）從功能上看，質(zhì)粒上存在核內(nèi)沒有的基因，賦予了原核生物并非必不可少的特殊功能，如：產(chǎn)毒、接合、抗藥、固氮等。從存在形式上看，是一種復制子，分為嚴緊型復制（與核染色體的復制同步）與松弛型復制（不與核染色體的復制同步）。（二）原核生物的質(zhì)粒第15頁/共94頁少量質(zhì)?？稍诓煌觊g轉(zhuǎn)移，如：F因子或R因子等。有些質(zhì)粒具有與核染色體發(fā)生整合或脫離的功能，稱附加體.如F因子。此外，質(zhì)粒還有基因重組功能，可在質(zhì)粒間、質(zhì)粒與核染色體之間發(fā)生基因重組。一些有代表性的質(zhì)粒：

F因子、R因子、Col質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒、巨大質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒。第16頁/共94頁F因子：又稱性因子，是E.coli等細菌決定性別的質(zhì)粒，當然除E.coli外，亦發(fā)現(xiàn)其他菌也有此質(zhì)粒。如假單胞菌屬、鏈球菌屬。有性菌毛的細菌體內(nèi)均含性質(zhì)粒，且性菌毛根數(shù)與性質(zhì)粒數(shù)目相等（1-4），故屬于松弛型。R因子：亦稱抗藥質(zhì)粒、R質(zhì)粒存在于細菌中，使菌體具有抗藥性的質(zhì)粒。最初是在痢疾桿菌中提取出來。Col質(zhì)粒：又稱大腸桿菌素質(zhì)粒，許多細菌都能產(chǎn)生使其他原核生物抑制或致死的蛋白質(zhì)類細菌毒素。大腸桿菌素都是由Col質(zhì)粒編碼。第17頁/共94頁Ti質(zhì)粒：亦稱誘癌質(zhì)粒主要存在于根癌菌株中，由Ti質(zhì)粒引起植物的根癌。巨大質(zhì)粒：比一般質(zhì)粒大幾十倍至幾百倍。其他質(zhì)粒：降解性質(zhì)粒只存在于假單胞菌屬，能夠編碼可降解復雜物質(zhì)的酶類。返回目錄第18頁/共94頁幾個重要概念：基因突變：簡稱突變，是遺傳物質(zhì)的分子結構或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳性的變化，可自發(fā)或誘導產(chǎn)生。野生型菌株：從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。突變株：即野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株。

第二節(jié)基因突變和誘變育種第19頁/共94頁一、基因突變（一）突變類型根據(jù)突變的菌株能否在選擇性培養(yǎng)基上加以鑒別，可分為：選擇性突變和非選擇性突變兩大類。前者在選擇性培養(yǎng)基上通過表型就可以區(qū)別開，主要有：營養(yǎng)缺陷型、抗性突變型、條件致死突變型；后者在選擇培養(yǎng)基上不能用表型區(qū)別開，主要有：形態(tài)突變型、抗原突變型、產(chǎn)量突變型。第20頁/共94頁——選擇性突變營養(yǎng)缺陷型：由于野生型基因發(fā)生突變，而喪失了合成某一種或某幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，無法在基本培養(yǎng)基上生長，此類菌株稱為營養(yǎng)缺陷型。抗性突變型：由于基因突變，野生型菌株產(chǎn)生了對某種理化因子抗性的突變類型。如一些抗生素抗藥性菌株。條件致死突變型：菌株在基因突變后，在一定條件下可正常地生長、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一條件下卻無法生長、繁殖，這類突變類型稱為條件致死突變型。例如：某些T4噬菌體突變株在25℃下可感染其宿主E.coli，而至37℃時卻不能感染。第21頁/共94頁——非選擇性突變形態(tài)突變型：指個體形態(tài)或群體形態(tài)因突變而與野生型不同。例如：S形菌落突變?yōu)镽形菌落，鞭毛有無或莢膜有無的突變。抗原突變型：由于突變使抗原結構與野生型不同。如：細胞壁缺陷變異（如L型細菌）。產(chǎn)量突變型：通過基因突變而獲得在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株。若產(chǎn)量顯著高于原始菌株者稱正突變，反之則稱負突變。第22頁/共94頁突變率：某一細胞（或病毒粒子）在某一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。如突變率為10-8表示細胞在1億次分裂過程中，會發(fā)生1次突變。突變是獨立發(fā)生的，互相不影響，同一細胞中同時發(fā)生兩個或兩個以上突變的幾率極低。雙重或多重突變的幾率是各個基因突變幾率的乘積。（二）突變率第23頁/共94頁自發(fā)性：是在沒有人為干涉的條件下產(chǎn)生的突。不對應性：指突變性狀與引起突變的原因之間無直接的對應關系。稀有性：一般突變尤其是自發(fā)突變，幾率極?。◣茁蕿?0-6-10-9）。獨立性：某基因的突變率不受它種基因突變率的影響?？烧T變性：使用誘變劑，可顯著提高突變幾率，在遺傳育種上較常用。穩(wěn)定性：突變后的新性狀可以穩(wěn)定地遺傳給下一代?？赡嫘裕河梢吧突蜃儺悶橥蛔冃突颍Q正向變異。由突變型基因返回到原始的野生型基因，稱回復突變。（三）突變的特點7個共同點：第24頁/共94頁（四）基因突變自發(fā)性和不對應性的實驗證明

變量實驗又稱彷徨試驗或波動實驗材料：噬菌體T1——涂布在平板上作為所抗的環(huán)境因素；對噬菌體T1敏感的E.coli——待實驗菌株結論：a.抗噬菌體T1突變型是自發(fā)產(chǎn)生的，且產(chǎn)生的越早，抗性菌落出現(xiàn)的就越多。

b.噬菌體T1僅起到淘汰原始未突變菌株和甄別抗噬菌體突變型的作用，并不是誘導因素。第25頁/共94頁變量試驗大腸桿菌稀釋培養(yǎng)物10ml10ml(在同一個大管中作整體培養(yǎng))(培養(yǎng)前先分成50小管)3714435抗噬菌體菌落數(shù)抗噬菌體菌落數(shù)第26頁/共94頁涂布試驗涂布敏感菌5×104個共12個平板5×104個菌落5000個細菌/菌落6個平板共353個菌落6個平板共28個菌落噴入T1保溫重新涂布后噴入T1保溫結論：該抗性突變發(fā)生在與噬菌體T1接觸之前，噬菌體的加入只起到甄別該類自發(fā)突變是否發(fā)生、存在，決不是誘發(fā)該類突變的原因。第27頁/共94頁影印培養(yǎng)試驗原始敏感菌種影印培養(yǎng)無藥培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基結論：對鏈霉素敏感的E.coliK12細胞在未接觸過任何一點鏈霉素的條件下，由1——2——4——5——6——8——9——10——12……的移種可篩選出大量抗鏈霉素的突變株。第28頁/共94頁(五）基因突變的機制

突變機制是多樣性的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，具體見下圖。第29頁/共94頁誘發(fā)突變：簡稱誘變，指通過人為的方法，利用物理、化學或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變幾率的手段。1.誘變機制誘變劑：能夠提高突變幾率的任何因素。堿基的置換

移碼突變

染色體畸變第30頁/共94頁（1） 堿基置換它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換，屬于典型的點突變。嘌呤置換嘌呤（嘧啶置換嘧啶）——轉(zhuǎn)換嘌呤置換嘧啶或者嘧啶置換嘌呤——顛換

A..TA..TA..TG..

CA..BU酮式G..BU烯醇式置換G..

CA..BUG..

BUA..BUG..

CA..T烯醇式酮式第31頁/共94頁（2）移碼突變指誘變劑使DNA序列中的一個或少數(shù)幾個核苷酸增加或減少，從而使該部位后面的全部遺傳密碼的閱讀框架改變，引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。移碼突變屬于DNA的輕微損傷，也是一種點突變，由移碼突變所產(chǎn)生的突變株稱為移碼突變株。移碼突變的幾種情況如下圖示

第32頁/共94頁第33頁/共94頁移碼突變的結果：正常鏈上增加或是缺失1、2或4、5個堿基時，均可引起移碼突變，而增加或缺失3或6個不影響讀碼，只引起較短的增加或缺失。第34頁/共94頁（3）染色體畸變包括染色體結構的缺失、重復、插入、易位、倒位幾種情況，也包括染色體數(shù)目的變化。

1〉染色體內(nèi)畸變：只涉及一條染色體上的變化，上述幾種均可發(fā)生。倒位：斷裂下來的一段染色體逆轉(zhuǎn)，然后，重新插入到原位置。易位：斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入同一染色體的其他部位上。

2〉染色體間畸變：非同源染色體間的易位。一小段DNA斷下后，可跳到另一條染色體上插入；質(zhì)粒上的DNA跳到另一個質(zhì)粒上，此種情況亦屬于染色體間畸變。（原核微生物僅一條染色體，不存在“另一條”。)

嚴格地說，DNA從一個細胞跳到另一個細胞的易位，亦屬于染色體間畸變?？傊?、真核微生物都存在染色體間畸變。第35頁/共94頁2.自發(fā)突變機制自發(fā)突變：生物體在無人工干預下自然發(fā)生的低頻突變。自發(fā)突變的原因一般有：背景輻射和環(huán)境因素的誘變例如：宇宙輻射、南北極磁場等。微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應例如：過氧化氫、過氧化物等。DNA復制過程中堿基配對錯誤引起據(jù)統(tǒng)計，DNA鏈在每次復制中每個堿基對錯配頻率是10-7-10-11，這樣一個基因的自發(fā)突變幾率約為10-6。第36頁/共94頁

紫外線對DNA的損傷是引起相鄰嘧啶形成嘧啶二聚體（TT，TC，CC）。造成局部DNA分子無法配對。微生物有多種修復受損DNA的作用，現(xiàn)舉兩例：光復活作用經(jīng)紫外線照射誘變的微生物立即暴露在可見光下，則微生物的死亡率和突變率將明顯降低的現(xiàn)象，稱光復活作用。機理：誘變形成的嘧啶二聚體在暗處結合光激活酶，在有可見光的情況下，此酶吸收光能，解離嘧啶二聚體。

暗修復作用又稱切除修復，經(jīng)紫外線誘變損傷的DNA在不見光的條件下，依靠微生物體內(nèi)的四種酶來修復受損的DNA。即：內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、DNA聚合酶、連接酶。過程如下圖（六）紫外線對DNA的損傷及其修復第37頁/共94頁第38頁/共94頁

二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種從生產(chǎn)中育種在利用微生物進行大生產(chǎn)的過程中，微生物會以10-6左右的突變率自發(fā)突變，其中可能出現(xiàn)一定幾率正突變株。2)定向培育優(yōu)良菌株。利用自然突變，對微生物群體采用特定的選擇條件選育出優(yōu)良菌株。但總的來說，方法古老，自發(fā)突變的目的性不強，周期長。第39頁/共94頁（二）誘變育種

誘變育種是指利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科學實驗或生產(chǎn)實踐使用。（無目的的誘變，有目的的篩選）第40頁/共94頁誘變育種的基本環(huán)節(jié)出發(fā)菌株計算出誘變大多死亡少數(shù)存活存活率多數(shù)未變少數(shù)突變突變率多數(shù)負變少數(shù)正變正變率多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大高產(chǎn)率投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)第41頁/共94頁2、誘變育種應考慮的幾個原則：

選擇簡便有效的誘變劑，如紫外線、激光和離子束，烷化劑、堿基類似物等。

艾姆斯試驗(Amestest）：是一種利用細菌營養(yǎng)缺陷型的回復突變來檢測環(huán)境或食品中是否存在化學致癌劑的簡便有效的方法.

利用微生物營養(yǎng)缺陷型（his—）的回復突變來檢測環(huán)境或食品中化學致癌劑。（“三致”致癌，致畸，致突變）第42頁/共94頁艾姆斯試驗(Amestest）：是一種利用細菌營養(yǎng)缺陷型的回復突變來檢測環(huán)境或食品中是否存在化學致癌劑的簡便有效的方法.

利用微生物營養(yǎng)缺陷型（his—）的回復突變來檢測環(huán)境或食品中化學致癌劑。（“三致”致癌，致畸，致突變）保溫可疑“三致”試樣

鼠肝勻漿（含羥化酶）

吸入濾紙片S.t.his陽性陰性S.t.his回變第43頁/共94頁挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株。A.選生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株;B.已具有優(yōu)良性狀的菌株;C.對誘變劑敏感性較高的菌株等。處理單細胞或單孢子懸液。目的：使每個細胞均勻接觸誘變劑并防止長出不純菌落。選用最佳誘變劑量。紫外線的劑量指強度與作用時間之乘積;化學誘變劑的劑量則以在一定外界條件下，誘變劑濃度與處理時間來表示。充分利用復合處理的協(xié)同效應。該法包括同一誘變劑的重復使用，兩種或多種誘變劑的先后或同時使用。第44頁/共94頁利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量之間相關指標。如淀粉水解試驗，就是利用淀粉酶變色圈（用碘液顯色）的大小來估計突變代謝產(chǎn)物量的多少。設計或創(chuàng)造高效篩選方案。如在實際中，篩選工作常分為初篩和復篩兩步進行。3、營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選（重點）1）與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關的三類培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基（MM，[-]）：僅能滿足某一微生物的野生型菌株生長所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基，（該培養(yǎng)基都是人工培養(yǎng)基，營養(yǎng)缺陷型菌株不能在其上生長）。第45頁/共94頁②完全培養(yǎng)基（CM，[+]）：所有營養(yǎng)缺陷型菌株均可在其上生長的培養(yǎng)基。一般地，完全培養(yǎng)基是天然或半人工合成的。③補充培養(yǎng)基（SM，[A]、[B]或[AB]）：凡只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基2）與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關的三類遺傳型個體①野生型：從自然界分離到的沒有發(fā)生過任何突變，可以在基本培養(yǎng)基上生長的菌株。②營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株因為突變，失去了合成某種酶的能力，使得該酶產(chǎn)物不能產(chǎn)生，只能在加有這種產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長的菌株。該型不能在[-]上生長，只能在[+]或相應的補充培養(yǎng)基上生長。該型非自身合成。第46頁/共94頁③原養(yǎng)性：營養(yǎng)缺陷型經(jīng)回變或其他的基因改造，回復為與野生型相同的形狀的菌株.（與野生型從現(xiàn)象上無任何區(qū)別。）3）營養(yǎng)缺陷型的篩選方法一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型、檢出和鑒定營養(yǎng)缺陷型四個步驟。①步誘變劑處理：與一般誘變處理相同②步淘汰野生型（即篩選出基因突變的類型），現(xiàn)舉兩種方法。A．抗生素法（最常用）。

a．青霉素：抑制細胞壁肽聚糖的合成，故可殺死生長、繁殖狀態(tài)的細菌，對休眠狀態(tài)的無用。方法：將誘變后的菌培養(yǎng)到含青霉素的基本培養(yǎng)基上，即野生型被淘汰，留下的為休眠狀態(tài)的營養(yǎng)缺陷型。第47頁/共94頁

b．制霉菌素：主要與真菌細胞膜上的甾醇作用，引起膜損傷。方法：將誘變后的孢子培養(yǎng)到含制霉菌素的基本培養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基長出菌絲者為營養(yǎng)缺陷型。B．菌絲過濾法：適用于進行絲狀生長的真菌和放線菌。其原理是：在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。可用大孔擦鏡紙反復過濾篩選出。第48頁/共94頁A．夾層培養(yǎng)法（“三明治”狀）

③步檢出缺陷型現(xiàn)舉出四種方法：小菌落是第二次長起來的（營養(yǎng)缺陷型）第49頁/共94頁B．限量補充培養(yǎng)法

在基本培養(yǎng)基上，加微量的天然成分（不同于補充培養(yǎng)基），營養(yǎng)缺陷型形成微菌落，而野生型形成正常大小的菌落。微量蛋白質(zhì)的完全培養(yǎng)基上小菌落是營養(yǎng)缺陷型突變株第50頁/共94頁C．逐個檢出法將誘變處理的細胞涂在含有完全培養(yǎng)基的平板，長成菌落，再將其接種至基本培養(yǎng)基上不長菌落（為營養(yǎng)缺陷型）。含誘變劑的液體培養(yǎng)基菌種涂布培養(yǎng)基本培養(yǎng)基上不長菌落完全培養(yǎng)基上長出菌落營養(yǎng)缺陷型第51頁/共94頁D．影印平板法完全培養(yǎng)基影印接種基本培養(yǎng)基將誘變處理的細胞涂不于含有完全培養(yǎng)基的平板，長出菌落，利用影印接種工具將該菌落轉(zhuǎn)移到另一個基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，亦長出菌落，將前后相應菌落對比，若前者生長，而后者不生長的菌落，為營養(yǎng)缺陷型（類似“平板影印培養(yǎng)試驗”）。第52頁/共94頁④步鑒定缺陷型（采用生長譜法）生長譜法:指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物,視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確定供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。操作：將營養(yǎng)缺陷型細胞（或孢子）洗下，用無菌水離心清洗，制成菌懸液并與基本培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，用含有不同營養(yǎng)物的濾紙片覆蓋，如某濾紙片周圍有微生物生長圈，則為該營養(yǎng)物的營養(yǎng)缺陷型。該法優(yōu)點：方法簡便，不怕污染菌，回復突變細胞不影響結果，此方法又可測定雙重或多重營養(yǎng)缺陷型。返回目錄第53頁/共94頁

第三節(jié)基因重組

基因重組的定義：把兩個不同性狀個體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新的遺傳型個體的方式，稱基因重組或遺傳重組?；蛑亟M可以理解成遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交，即核酸水平上的雜交。而傳統(tǒng)意義上的雜交通常指的是細胞水平的雜交，如雜交動物、雜交植物等。但所有細胞水平上的雜交都是以基因重組為基礎的。微生物的基因重組分原核微生物和真核微生物兩大類進行研究。第54頁/共94頁一、原核微生物的基因重組

原核微生物的基因重組包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、結合和原生質(zhì)體融合等四種形式。第55頁/共94頁（一）轉(zhuǎn)化

受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段，通過交換、把它整合到自己的基因組中，從而使受體菌獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的結果是形成轉(zhuǎn)化子。即轉(zhuǎn)化子是通過轉(zhuǎn)化獲得供體細胞部分遺傳物質(zhì)并表現(xiàn)出相應性狀的重組受體菌。而來自供體菌的DNA片段稱轉(zhuǎn)化因子。轉(zhuǎn)化過程見下圖

第56頁/共94頁第57頁/共94頁（一）轉(zhuǎn)化

兩個菌株間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化與多種因素有關，如兩個菌株進化過程中的親緣關系、供體DNA的形式及菌株的具體生理狀態(tài)等，其中最重要的是受體菌生理狀態(tài)——感受態(tài)。供體的DNA片段形式：不同形式的供體菌DNA片段，發(fā)生轉(zhuǎn)化的頻率也有區(qū)別，其中質(zhì)粒形式的DNA片段發(fā)生轉(zhuǎn)化的頻率最高。第58頁/共94頁（一）轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)染：將噬菌體或病毒的DNA或RNA提取出來，再去感染感受態(tài)的宿主細胞，進而產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代的現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染的不同：轉(zhuǎn)化是受體菌接受供體菌的DNA片斷、發(fā)生基因重組并產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)染過程不發(fā)生基因重組，受體菌僅接受噬菌體或病毒的DNA或RNA、不產(chǎn)生雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子，產(chǎn)生的是大量的子代噬菌體或病毒。第59頁/共94頁（二）轉(zhuǎn)導

轉(zhuǎn)導：通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，將供體菌的DNA片段攜帶到受體菌中，通過交換、整合，使后者獲得前者遺傳性狀的現(xiàn)象，稱之為轉(zhuǎn)導。轉(zhuǎn)導子：通過轉(zhuǎn)導獲得供體細胞部分遺傳性狀的重組受體細胞稱為轉(zhuǎn)導子。轉(zhuǎn)導噬菌體：攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導噬菌體或轉(zhuǎn)導顆粒。分類：普遍轉(zhuǎn)導局部轉(zhuǎn)導第60頁/共94頁（二）轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導的區(qū)別：轉(zhuǎn)化：受體菌直接接受供體菌DNA片段。轉(zhuǎn)導：受體菌通過噬菌體接受供體菌DNA片段。第61頁/共94頁

１、普遍轉(zhuǎn)導（1）完全普遍轉(zhuǎn)導完全缺陷噬菌體：當某噬菌體感染供體菌后，在供體菌內(nèi)增殖時，使供體菌的DNA被切成許多片段，成熟后少數(shù)衣殼將供體菌的DNA片段（要求與噬菌體核酸片段相仿）“誤包”，形成假噬菌體，即完全缺陷噬菌體;當供體菌被裂解此完全缺陷噬菌體釋放后，再次感染受體菌，即可把外源（供體菌）的DNA片段介導到受體菌中，實現(xiàn)交換和整合，這就是完全普遍轉(zhuǎn)導。第62頁/共94頁完全普遍性轉(zhuǎn)導(compietetransduction)供體A-B+A+B-多數(shù)受體形成溶源菌A-B+A+B-少數(shù)受體A+B+經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導子A-B+色氨酸缺陷型A+B-組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌第63頁/共94頁

（2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導完全缺陷噬菌體感染受體后，所攜帶的DNA片段沒有和受體菌的DNA片段交換、整合、復制，但可以轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生相應的代謝產(chǎn)物，有相應的表型；受體菌再經(jīng)分裂、繁殖，子一代只有一半獲得供體菌的DNA片段，另一半僅得到部分代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出輕微的供體菌特征，在繼續(xù)分裂的過程中，逐漸被稀釋，此現(xiàn)象稱為流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導。見下圖：第64頁/共94頁第65頁/共94頁

2、局部轉(zhuǎn)導部分缺陷噬菌體:溫和噬菌體感染受體菌后，使宿主溶源化。該溶源菌因誘導發(fā)生裂解時，其中極少數(shù)的前噬菌體會發(fā)生不正常切離，將噬菌體結合位點兩側(cè)之一的少數(shù)基因連接到噬菌體DNA上，同時噬菌體也會將相應的一段DNA留在宿主染色體組上，最后噬菌體的衣殼將非正常切離的噬菌體染色體進行誤包，即形成了部分缺陷噬菌體。

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2、局部轉(zhuǎn)導定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體將供體的少數(shù)特定的基因攜帶到受體菌，并得到表達的轉(zhuǎn)導現(xiàn)象，稱之為局部轉(zhuǎn)導.

局部轉(zhuǎn)導的特點：（1）只能轉(zhuǎn)導供體菌的個別特定基因（噬菌體整合位點兩側(cè)的基因）。（2）特定基因由部分缺陷型的噬菌體攜帶。（3）缺陷噬菌體是由于其在形成過程中產(chǎn)生的低頻率“誤切”，或雙重溶原菌的裂解而成。分類：局部轉(zhuǎn)導按其轉(zhuǎn)導頻率的高低可分為低頻轉(zhuǎn)導（LFT）和高頻轉(zhuǎn)導（HFT）兩大類。第67頁/共94頁

（1）低頻轉(zhuǎn)導（LFT）溫和噬菌體感染受體菌后使宿主溶源化，該溶源菌因誘導后發(fā)生裂解，形成10-5比例的部分缺陷噬菌體，他們感染受體菌后發(fā)生交換、整合，形成轉(zhuǎn)導子（局限轉(zhuǎn)導子），而不是溶源菌，不具免疫性，亦稱低頻局限轉(zhuǎn)導。見下圖第68頁/共94頁第69頁/共94頁

（2）高頻轉(zhuǎn)導（HFT）用低頻裂解物（含10-5的部分缺陷噬菌體）來感染受體菌，即有10-5變?yōu)榈皖l局限轉(zhuǎn)導子，再用高感染復數(shù)的正常噬菌體去感染低頻轉(zhuǎn)導子，此時的低頻轉(zhuǎn)導子稱為雙重溶源菌，它被誘導后可產(chǎn)生裂解，正常的噬菌體可協(xié)助缺陷噬菌體進行等量復制，用這樣的裂解物（高頻裂解物，含50%正常噬菌體）再去感染受體菌，進行高頻轉(zhuǎn)導，亦稱高頻局限轉(zhuǎn)導。第70頁/共94頁（三）溶源轉(zhuǎn)變溫和噬菌體感染其宿主而使其發(fā)生溶源化時，將噬菌體的基因整合到宿主的核基因組形成前噬菌體，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導的區(qū)別：

1、溫和噬菌體本身不攜帶外源基因，使宿主帶有新性狀的是噬菌體本身的基因。

2、溫和噬菌體是完整的非缺陷的。

3、獲得新性狀的是溶源化的宿主細胞而不是轉(zhuǎn)導子。

4、獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時消失。第71頁/共94頁（四）接合供體菌（雄性）通過性菌毛與受體菌接觸，前者將不同長度的單鏈DNA片段傳遞給后者并在后者細胞中雙鏈化，進一步與核染色體交換、整合，使受體菌獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得供體菌性狀的受體細胞，稱為接合子。第72頁/共94頁通過細胞間的直接接觸能進行大段ＤＮＡ的轉(zhuǎn)移的過程，叫接合接合及其發(fā)現(xiàn)+A+B+C-D-

A-B-C+D+

A+B+C+D+第73頁/共94頁（四）接合以E.coli為例，按細胞內(nèi)有無F因子及其存在方式的不同可分為四種：

1、F+（雄性）菌株有游離的F因子1—4個，體外有對應數(shù)量的性菌毛，當其與F-菌株接合時，通過性菌毛可將F因子傳遞給后者，使之轉(zhuǎn)變?yōu)镕+菌株。

2、F-(雌性)菌株體內(nèi)無F因子，體外亦無性菌毛，它可通過與F+菌株、F′菌株或Hfr菌株接合而接受F因子或F′因子，使自己變成“雄性”菌株，也可接受來至Hfr菌株的一部分或全部遺傳信息。第74頁/共94頁

3、Hfr（高頻重組）菌株因其與F-菌株結合后，發(fā)生重組的頻率比F+要高數(shù)百倍，故得名。在這樣的菌體內(nèi)，F(xiàn)因子呈整合狀態(tài)，整合位點固定；當它與F-結合時，Hfr菌株的染色體在F因子處斷裂，由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，F(xiàn)因子位于線性DNA的末端。然后整條線性染色體以等速轉(zhuǎn)移至F-菌株內(nèi)，因轉(zhuǎn)移所需時間較長，且容易發(fā)生中斷，導致Hfr與F-結合的結果其重組頻率最高，但轉(zhuǎn)性頻率最低。第75頁/共94頁

4、F′菌株當Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切離而脫離染色體時，形成帶了一小段Hfr染色體基因的特殊F因子，即F′因子。此時的性狀界于Hfr與F+菌株之間，稱初生F′菌株；F′菌株與F-菌株結合，后者也變成F′菌株。它既獲得了F因子，又獲得了來自初生F′菌株的若干新性狀，成為次生F′菌株。次生F′細胞是一部分雙倍體。以這種結合來傳遞供體基因的方式，稱為F因子轉(zhuǎn)導、性導、F質(zhì)粒媒介的轉(zhuǎn)導。第76頁/共94頁第77頁/共94頁(五)原生質(zhì)體融合

通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、穩(wěn)定的融合子的過程。

第78頁/共94頁第79頁/共94頁原生質(zhì)體融合的主要步驟：①親本選擇選擇兩個有特殊價值的，并帶有選擇性遺傳標記的細胞作為親本；②原生質(zhì)體制備在高滲溶液中，利用脫壁酶（溶菌酶）進行親本脫壁，形成原生質(zhì)體；③原生質(zhì)體融合加入促融合劑（如PEG）或電脈沖等促進融合；④融合子鑒定先在能使細胞壁再生的培養(yǎng)基上進行涂布培養(yǎng)，待形成菌落后，再影印接種到選擇性培養(yǎng)基上，鑒定其是否為融合子；⑤生物學性狀及生長性能測定。第80頁/共94頁原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)第81頁/共94頁二、真核微生物基因重組（一）有性雜交：凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都可以通過性細胞的接合而發(fā)