微生物生長繁殖五

微生物生長繁殖五第1頁/共117頁第五章微生物的生長繁殖與生存因子第2頁/共117頁生物個(gè)體物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致個(gè)體體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程。生長：生物個(gè)體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。繁殖：生長是一個(gè)逐步發(fā)生的量變過程，繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的質(zhì)變過程。在高等生物里這兩個(gè)過程可以明顯分開，但在低等特別是在單細(xì)胞的生物里，由于細(xì)胞小，這兩個(gè)過程是緊密聯(lián)系又很難劃分的過程。第一節(jié)微生物的生長繁殖第3頁/共117頁一個(gè)微生物細(xì)胞合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用個(gè)體的生長原生質(zhì)的總量（重量、體積、大?。┚筒粩嘣黾尤绻骷?xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L時(shí)，則達(dá)到一定程度后就會(huì)發(fā)生繁殖，引起個(gè)體數(shù)目的增加。群體內(nèi)各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長群體的生長第4頁/共117頁一、微生物生長的測(cè)定:單位時(shí)間里微生物數(shù)量或生物量（Biomass）的變化微生物生長：微生物生長的測(cè)定：個(gè)體計(jì)數(shù)群體重量測(cè)定群體生理指標(biāo)測(cè)定評(píng)價(jià)培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)微生物生長的影響；評(píng)價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律；第5頁/共117頁（一）以數(shù)量變化對(duì)微生物生長情況進(jìn)行測(cè)定1、培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法第6頁/共117頁采用培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確，否則難以得到正確的結(jié)果：樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒只能接觸一個(gè)稀釋度的菌液；同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù),取平均值；每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。第7頁/共117頁2、膜過濾培養(yǎng)法當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。第8頁/共117頁3、Themostprobablenumbermethod（液體稀釋法）主要適用于只能進(jìn)行液體培養(yǎng)的微生物，或采用液體鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行直接鑒定并計(jì)數(shù)的微生物。對(duì)未知樣品進(jìn)行十倍稀釋，然后根據(jù)估算取三個(gè)連續(xù)的稀釋度平行接種多支試管，對(duì)這些平行試管的微生物生長情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，長菌的為陽性，未長菌的為陰性，然后根據(jù)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)計(jì)算出樣品中的微生物數(shù)目。第9頁/共117頁4、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1）常規(guī)方法：缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；第10頁/共117頁2）其它方法：將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測(cè)細(xì)胞細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測(cè)微生物細(xì)胞濃度。比例計(jì)數(shù)：過濾計(jì)數(shù)：當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù)；活菌計(jì)數(shù)：采用特定的染色技術(shù)也可分別對(duì)活菌和死菌進(jìn)行分別計(jì)數(shù)第11頁/共117頁（二）以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長1、比濁法在一定波長下，測(cè)定菌懸液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)應(yīng)控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。第12頁/共117頁2、生理指標(biāo)法微生物的生理指標(biāo)，如呼吸強(qiáng)度，耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關(guān)。樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等設(shè)備來測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo)。常用于對(duì)微生物的快速鑒定與檢測(cè)第13頁/共117頁二、細(xì)菌的群體生長繁殖微生物的特點(diǎn)：個(gè)體微小肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個(gè)單個(gè)的微生物組成的群體。微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體繁殖生長。對(duì)細(xì)菌群體生長規(guī)律的了解是對(duì)其進(jìn)行研究與利用的基礎(chǔ)第14頁/共117頁一、生長曲線生長曲線(GrowthCurve)：

細(xì)菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，以培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo)，以菌數(shù)為縱座標(biāo)作圖，得到的一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。在微生物學(xué)中提到的“生長”，均指群體生長。第15頁/共117頁細(xì)菌的生長曲線一般用菌數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖第16頁/共117頁一條典型的生長曲線至少可以分為

遲緩期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期和衰亡期等四個(gè)生長時(shí)期第17頁/共117頁遲緩期(Lagphase)：將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時(shí)間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。也稱延遲期、適應(yīng)期。第18頁/共117頁遲緩期的特點(diǎn)：分裂遲緩、代謝活躍細(xì)胞形態(tài)變大或增長，例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細(xì)胞的平均長度比剛接種時(shí)長6倍。一般來說處于遲緩期的細(xì)菌細(xì)胞體積最大細(xì)胞內(nèi)RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。對(duì)外界不良條件反應(yīng)敏感。細(xì)胞處于活躍生長中，只是分裂遲緩在此階段后期，少數(shù)細(xì)胞開始分裂，曲線略有上升。第19頁/共117頁對(duì)數(shù)生長期(Logphase)：又稱指數(shù)生長期(Exponentialphase)以最大的速率生長和分裂，細(xì)菌數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加，細(xì)菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，表現(xiàn)為平衡生長。對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌個(gè)體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長迅速、代時(shí)穩(wěn)定，所以是研究微生物基本代謝的良好材料。它也常在生產(chǎn)上用作種子，使微生物發(fā)酵的遲緩期縮短，提高經(jīng)濟(jì)效益。第20頁/共117頁穩(wěn)定生長期(Stationaryphase)：由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化，逐步不適宜于細(xì)菌生長，導(dǎo)致生長速率降低直至零(即細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù))。穩(wěn)定生長期又稱恒定期或最高生長期，此時(shí)培養(yǎng)液中活細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。第21頁/共117頁衰亡期(Decline或Deathphase)：營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)菌死亡速率超過新生速率，整個(gè)群體呈現(xiàn)出負(fù)增長。該時(shí)期死亡的細(xì)菌以對(duì)數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會(huì)使細(xì)菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。第22頁/共117頁二、同步培養(yǎng)同步培養(yǎng)(Synchronousculture)：

使群體中的細(xì)胞處于比較一致的，生長發(fā)育均處于同一階段上，即大多數(shù)細(xì)胞能同時(shí)進(jìn)行生長或分裂的培養(yǎng)方法。

以同步培養(yǎng)方法使群體細(xì)胞能處于同一生長階段，并同時(shí)進(jìn)行分裂的生長。同步生長：通過同步培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞被稱為同步細(xì)胞或同步培養(yǎng)物第23頁/共117頁硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長的方法由于細(xì)胞的個(gè)體差異，同步生長往往只能維持2-3個(gè)世代，隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長。第24頁/共117頁三、連續(xù)培養(yǎng)將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲。分批培養(yǎng)（batchculture）or封閉培養(yǎng)（closedculture）培養(yǎng)基一次加入，不予補(bǔ)充，不再更換。連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。培養(yǎng)過程中不斷的補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物是實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。第25頁/共117頁（一）恒濁連續(xù)培養(yǎng)測(cè)定所培養(yǎng)微生物的光密度值自動(dòng)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度當(dāng)培養(yǎng)室中的濁度超過預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速加快，使?jié)岫冉档停划?dāng)培養(yǎng)室中的濁度低于預(yù)期數(shù)值時(shí)，流速減慢，使?jié)岫壬撸缓銤崤囵B(yǎng)器的工作精度是由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來決定的如果所用培養(yǎng)基中有過量的必需營養(yǎng)物，就可以使菌體維持最高的生長速率。第26頁/共117頁二）恒化連續(xù)培養(yǎng)使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率下進(jìn)行生長繁殖。第27頁/共117頁通過控制流速可以得到生長速率不同但密度基本恒定的培養(yǎng)物多用于科研遺傳學(xué)：突變株分離；生理學(xué)：不同條件下的代謝變化；生態(tài)學(xué)：模擬自然營養(yǎng)條件建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；?8頁/共117頁第六章微生物的營養(yǎng)和產(chǎn)能代謝

第一節(jié)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)

微生物的營養(yǎng)物質(zhì)按其在機(jī)體中的生理作用可區(qū)分為：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子和水五大類。第29頁/共117頁(一)、碳源1、定義：任何作為構(gòu)成微生物的細(xì)胞物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物中碳素來源的營養(yǎng)物質(zhì)。2、功能：(1)構(gòu)成微生物自身細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物；能源物質(zhì)；所以，碳源不足會(huì)引起菌體衰老或死亡。但有些又以CO2為唯一或主要碳源的微生物生長所需的能源則不是來自CO2。

第30頁/共117頁3、碳源物質(zhì)的種類及微生物的利用(1)有機(jī)碳化合物：簡(jiǎn)單有機(jī)碳化合物：復(fù)雜有機(jī)碳化合物：(2)無機(jī)碳化合物：

(3)特殊和有毒碳化合物：第31頁/共117頁(二)、氮源1、定義：凡是可以被微生物用來構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的或代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)。2、功能：蛋白質(zhì)及其各類降解產(chǎn)物N源不足，菌體生長過慢；過多，微生物生長過旺而不利于產(chǎn)物的積累。第32頁/共117頁3、氮源物質(zhì)的種類及微生物的利用(1)有機(jī)氮化物：簡(jiǎn)單有機(jī)氮化物：氨基酸、蛋白胨等；復(fù)雜有機(jī)氮化物：蛋白質(zhì)、核酸等。(2)無機(jī)氮化物：銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽(少數(shù)微生物能利用)。

(3)分子態(tài)氮：少數(shù)固氮微生物能利用，如固氮菌。第33頁/共117頁(三)、無機(jī)鹽(inorganicsalt)1、定義：無機(jī)鹽是微生物生長必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì)，生理功能主要是①作為酶活性中心②維持生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、③調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞的滲透壓平衡、④控制細(xì)胞的氧化還原電位⑤作為某些微生物生長的能源物質(zhì)等。第34頁/共117頁2、對(duì)無機(jī)鹽的需要情況大量元素：P、K、Mg、Ca、S、Na、(Fe)，生長需要的濃度：10-3-10-4mol/L；微量元素：Fe、B、Cu、Zn、Mo、Co、Mn，生長需要的濃度：10-6-10-8

mol/L(培養(yǎng)基中含量)。第35頁/共117頁(四)、生長因子(growthfactor)1、定義：生長因子通常指某些微生物生長所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以滿足機(jī)體生長需要的有機(jī)化合物。不同微生物對(duì)生長因子的需要量和種類不同。第36頁/共117頁2、種類及功能：生長因子分為維生素是作為酶的輔基或輔酶參與新陳代謝；氨基酸:有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，嘌呤與嘧啶作用主要是作為酶的輔酶或輔基，第37頁/共117頁(五)、水(1)細(xì)胞的組成成分(2)細(xì)胞生化反應(yīng)的介質(zhì)；(3)起溶劑與運(yùn)輸介質(zhì)的作用，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌必須以水為介質(zhì)才能完成；(4)維持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子穩(wěn)定的天然構(gòu)象；(5)調(diào)節(jié)體細(xì)胞的溫度；(6)保持充足的水分是細(xì)胞維持自身正常形態(tài)的重要因素，即維持細(xì)胞內(nèi)一定膨壓；

第38頁/共117頁第二節(jié)

微生物的營養(yǎng)類型

1、光能無機(jī)自養(yǎng)型：也稱光能自養(yǎng)型，能以CO2為唯一碳源或主要碳源并利用光能進(jìn)行生長的的微生物，使CO2固定還原成細(xì)胞物質(zhì)，并且伴隨元素氧（硫）的釋放。藻類、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌屬于這一類營養(yǎng)類型。第39頁/共117頁藻類和藍(lán)細(xì)菌與高等植物光合作用是一致的

第40頁/共117頁2、光能有機(jī)營養(yǎng)型或稱光能異養(yǎng)型，不能以CO2作為唯一碳源或主要碳源，需以有機(jī)物作為供氫體，利用光能將CO2還原為細(xì)胞物質(zhì)。紅螺屬的一些細(xì)菌就是這一營養(yǎng)類型的代表光能有機(jī)營養(yǎng)型細(xì)菌在生長時(shí)通常需要外源的生長因子。

第41頁/共117頁3、化能無機(jī)自養(yǎng)型：或稱化能自養(yǎng)型，利用無機(jī)物氧化過程中放出的化學(xué)能作為它們生長所需的能量，以CO2或碳酸鹽作為的唯一或主要碳源進(jìn)行生長，屬于這類微生物的類群有硫化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、氫細(xì)菌與鐵細(xì)菌等.第42頁/共117頁4、化能有機(jī)營養(yǎng)型：或稱化能異養(yǎng)營養(yǎng)型，生長所需的能量來自有機(jī)物氧化過程放出的化學(xué)能，有機(jī)物通常既是它們生長的碳源物質(zhì)又是能源物質(zhì)。

第43頁/共117頁微生物營養(yǎng)類型(Ⅰ)依據(jù)營養(yǎng)類型特點(diǎn)

碳源自養(yǎng)型(autotrophs)以CO2為唯一或主要碳源異養(yǎng)型(heterotrophs)以有機(jī)物為碳源

能源光能營養(yǎng)型(phototrophs)以光為能源化能營養(yǎng)型(chemotrophs)以有機(jī)物氧化釋放的化學(xué)能為能源

電子供體

無機(jī)營養(yǎng)型(lithotrophs)以還原性無機(jī)物為電子供體有機(jī)營養(yǎng)型(organotrophs)以有機(jī)物為電子供體第44頁/共117頁微生物的營養(yǎng)類型（Ⅱ）

營養(yǎng)類型光能無機(jī)自養(yǎng)型光能有機(jī)異養(yǎng)型化能無機(jī)自養(yǎng)型化能有機(jī)異養(yǎng)型能源光能光能化學(xué)能化學(xué)能主要碳源CO2CO2CO2有機(jī)物第45頁/共117頁大多數(shù)微生物屬于化能有機(jī)營養(yǎng)型：絕大多數(shù)的細(xì)菌、全部真菌、原生動(dòng)物以及病毒。如果化能有機(jī)營養(yǎng)型微生物利用的有機(jī)物不具有生命活性，則是腐生型；若是生活在生活細(xì)胞內(nèi)從寄生體內(nèi)獲得營養(yǎng)物質(zhì)，則是寄生型。

第46頁/共117頁第三節(jié)培養(yǎng)基

一、什么是培養(yǎng)基培養(yǎng)基(culturemedium)：是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中應(yīng)含滿足微生物生長發(fā)育的：水分、碳源、氮源、生長因子以及無機(jī)鹽。第47頁/共117頁配制培養(yǎng)基的原則一、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)所有微生物生長繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、水及能源，第48頁/共117頁培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌所需的培養(yǎng)基各不相同。1.培養(yǎng)細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(或簡(jiǎn)稱普通肉湯培養(yǎng)基)，2.培養(yǎng)放線菌：用高氏I號(hào)合成培養(yǎng)基，3.培養(yǎng)酵母菌：一般用麥芽汁培養(yǎng)基，4.培養(yǎng)霉菌：一般用查氏合成培養(yǎng)基。第49頁/共117頁二、營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低時(shí)不能滿足微生物正常生長所需，濃度過高時(shí)則可能對(duì)微生物生長起抑制作用，例如高濃度糖類物質(zhì)、無機(jī)鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進(jìn)微生物的生長，反而起到抑菌或殺菌作用。第50頁/共117頁培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和(或)代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比(C/N)的影響較大。第51頁/共117頁三、控制pH條件

各類微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適pH條件各不相同。細(xì)菌與放線菌適于在pH7～7.5范圍內(nèi)生長，酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6范圍內(nèi)生長。（如何控制生長過程中的PH值？）第52頁/共117頁pH緩沖劑維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，常用的緩沖劑是一氫和二氫磷酸鹽(如KH2PO4和K2HPO4)組成的混合物。K2HPO4溶液呈堿性，KH2PO4溶液呈酸性，兩種物質(zhì)的等量混合溶液的pH為6.8。第53頁/共117頁KH2PO4和K2HPO4緩沖劑的原理當(dāng)培養(yǎng)基中酸性物質(zhì)積累導(dǎo)致H+濃度增加時(shí)，H+與弱堿性鹽結(jié)合形成弱酸性化合物，培養(yǎng)基pH不會(huì)過度降低；如果培養(yǎng)基中OH-濃度增加，OH-則與弱酸性鹽結(jié)合形成弱堿性化合物，培養(yǎng)基pH也不會(huì)過度升高。但KH2PO4和K2HPO4緩沖系統(tǒng)只能在一定的pH范圍(pH6.4～7.2)內(nèi)起調(diào)節(jié)作用。第54頁/共117頁有些微生物，如乳酸菌能大量產(chǎn)酸，磷酸緩沖系統(tǒng)就難以起到緩沖作用，此時(shí)可在培養(yǎng)基中添加難溶的碳酸鹽(如CaCO3)來進(jìn)行調(diào)節(jié)，CaCO3難溶于水，不會(huì)使培養(yǎng)基pH過度升高，但它可以不斷中和微生物產(chǎn)生的酸，同時(shí)釋放出CO2，將培養(yǎng)基pH控制在一定范圍內(nèi)。第55頁/共117頁四、原料來源的選擇盡量利用廉價(jià)且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成分，在發(fā)酵工業(yè)中，培養(yǎng)基用量很大，利用低成本的原料更體現(xiàn)出其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。第56頁/共117頁五、滅菌處理要獲得微生物純培養(yǎng)，必須避免雜菌污染，對(duì)培養(yǎng)基一般采取高壓蒸汽滅菌，一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm2，121.3℃條件下維持15～30min可達(dá)到滅菌目的。滅菌：采用物理或化學(xué)的方法殺死一定環(huán)境中的全部微生物。消毒：采用物理或化學(xué)的方法殺死一定環(huán)境中部份的部微生物。主要是病原微生物。第57頁/共117頁在高壓蒸汽滅菌過程中，長時(shí)間高溫會(huì)使某些不耐熱物質(zhì)遭到破壞，如使糖類物質(zhì)形成氨基糖、焦糖，長時(shí)間高溫還會(huì)引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子(特別是鈣、鎂、鐵離子)結(jié)合形成難溶性復(fù)合物而產(chǎn)生沉淀，高壓蒸汽滅菌后，培養(yǎng)基pH會(huì)發(fā)生改變(一般使pH降低0.2)，第58頁/共117頁滅菌的方法(1)物理法①加熱法：ⅰ.干熱滅菌灼燒滅菌：利用火焰直接把微生物燒滅。如：接種工具，玻璃瓶口等。干燥熱空氣滅菌(常稱干熱滅菌)：把待滅菌的物品均勻地放在電熱恒溫干燥箱內(nèi)，加熱至160-170℃，持續(xù)2hr。如：玻璃器皿(吸管、平板等)、金屬用具等；但培養(yǎng)基、塑料制品、橡膠制品等不能用此法。第59頁/共117頁ⅱ濕熱滅菌：★高壓蒸汽滅菌：121℃，30min。滅菌器主要有臥式、立式、手提式(實(shí)驗(yàn)室最為常用)。是一種最有效、使用最廣泛的滅菌方法?！锍赫羝麥缇洪g歇(分段)滅菌：100℃，30min，殺死一切細(xì)菌的營養(yǎng)體，但不能殺死芽孢，每天進(jìn)行1次，連續(xù)3天；在兩次滅菌間隙，滅菌物應(yīng)放在室溫(20-30℃)條件下恒溫培養(yǎng)，使芽孢萌發(fā)為營養(yǎng)體，第二次滅菌即可殺死；經(jīng)過兩次培養(yǎng)3次反復(fù)滅菌，即可達(dá)完全滅菌。第60頁/共117頁持續(xù)滅菌：常壓蒸汽持續(xù)滅菌中，從蒸汽大量產(chǎn)生開始，繼續(xù)加大火力保持充足蒸汽，持續(xù)加熱3-6hr，殺死絕大部分芽孢和全部營養(yǎng)體，達(dá)到滅菌目的。第61頁/共117頁比較：在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。因?yàn)椋孩贊駸崆闆r下，菌體吸水，使蛋白質(zhì)易于凝固；②濕熱的穿透力更強(qiáng)；③蒸汽與被滅菌物接觸冷凝成水時(shí)，放出熱量，使其溫度迅速升高，從而增強(qiáng)了殺菌能力。第62頁/共117頁ⅲ煮沸消毒法物品在清水中煮沸5min以上，可殺死附在物品上的微生物細(xì)胞及部份芽孢。如果延長煮沸時(shí)間，或在水中加入1%碳酸鈉或2-5%石碳酸，則效果會(huì)更好。本法適于毛巾衣物、注射器、解剖用具等的消毒。ⅳ巴斯德消毒法：63℃，30min；或70℃，15min。一般用于牛奶、啤酒等的消毒，可保持物品原有的營養(yǎng)風(fēng)味。

第63頁/共117頁②過濾除菌：含菌液體或氣體通過細(xì)菌過濾器，使雜菌留在濾器或?yàn)V板上，而支除雜菌。③射線除菌：紫外線穿透力弱，一薄層普通玻璃或水，均能濾除大量紫外線。一般適用于表面滅菌或空氣滅菌，如：實(shí)驗(yàn)室、接種室、接種箱等。第64頁/共117頁(2)化學(xué)法：主要是利用有機(jī)或無機(jī)的化學(xué)藥品以實(shí)驗(yàn)室用具和其它物體表面進(jìn)行滅菌與消毒(不能殺死芽孢，起消毒作用)。機(jī)理：能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑。實(shí)驗(yàn)室常用有：升汞、甲醛、高錳酸鉀、乙醇、碘酒、石碳酸、漂白粉等。在配制培養(yǎng)基過程中，泡沫的存在對(duì)滅菌處理有何影響？第65頁/共117頁三、培養(yǎng)基的類型以及應(yīng)用

(一)按成分不同劃分天然培養(yǎng)基(complexmedium)：。合成培養(yǎng)基(syntheticmedium)

半合成培養(yǎng)基：第66頁/共117頁天然培養(yǎng)基(complexmedium)：凡是利用來自生物的組織、器官以用它們的抽提物或制品制成的培養(yǎng)基。如：牛肉汁、玉米粉、米糠。其化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定，也稱化學(xué)限定培養(yǎng)基。如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。第67頁/共117頁合成培養(yǎng)基(syntheticmedium)是由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)(化學(xué)藥品)配制而成的培養(yǎng)基。也稱化學(xué)限定培養(yǎng)基。如：高氏一號(hào)培養(yǎng)基等。第68頁/共117頁半合成培養(yǎng)基采用天然有機(jī)物作為N源和生長物質(zhì)，再添加一部分的化學(xué)藥品作為C源和無機(jī)鹽來源的培養(yǎng)基。第69頁/共117頁二）根據(jù)物理狀態(tài)劃分液體培養(yǎng)基：根據(jù)配方溶于定量的水制成。固體培養(yǎng)基：①在液體培養(yǎng)基中，添加凝固劑。常用的凝固劑有瓊脂(或稱洋菜、凍粉)、明膠、硅酸鈉等，以瓊脂最為常見。②固體材料可看作是一種不加凝固劑的固體培養(yǎng)基。半固體培養(yǎng)基：一般在液體培養(yǎng)基中加入2‰-5‰瓊脂即成。第70頁/共117頁瓊脂瓊脂：成分主要是多糖類物質(zhì)(瓊脂糖約70%，瓊脂果膠約30%)，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用作凝固劑不引起化學(xué)成分的變化；在95℃以上的熱水中開始由凝膠融化為溶膠，冷卻至45℃以下開始重新凝固，反復(fù)多次性質(zhì)不變；用量：15‰-20‰。第71頁/共117頁明膠明膠：化學(xué)成分是動(dòng)物蛋白質(zhì)。一般在25℃以上即融化，22℃以下凝固，所以不能作為常用的凝固劑少數(shù)微生物能分解利用使之液化，于是多用于穿刺培養(yǎng)；用量：10%-20%或更多。第72頁/共117頁(三)按用途劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimummedium)

加富培養(yǎng)基(enrichmentmedium)鑒別培養(yǎng)基(differentialmedium)選擇培養(yǎng)基(selectivemedium)第73頁/共117頁基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimummedium)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimummedium)是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。如：細(xì)菌——牛肉膏蛋白胨；酵母菌——麥芽汁；真菌——馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。第74頁/共117頁加富培養(yǎng)基(enrichmentmedium)加富培養(yǎng)基(enrichmentmedium)也稱增殖培養(yǎng)基，加入特殊營養(yǎng)物質(zhì)，使這類微生物增殖速度比其它微生物快。這些特殊營養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動(dòng)植物組織液等。第75頁/共117頁鑒別培養(yǎng)基(differentialmedium)鑒別培養(yǎng)基(differentialmedium)加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng).第76頁/共117頁選擇培養(yǎng)基(selectivemedium)選擇培養(yǎng)基(selectivemedium)將某種微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。①依據(jù)某些微生物的特殊營養(yǎng)需求設(shè)計(jì)的。②加入某種化學(xué)物質(zhì)，這種化學(xué)物質(zhì)沒有營養(yǎng)作用，對(duì)所需分離的微生物無害，但可以抑制或殺死其他微生物。第77頁/共117頁例1：培養(yǎng)基中加入適量的青霉素或鏈霉素，可抑制細(xì)菌和放線菌的生長，從而將真菌和酵母菌分離出來；例2：在馬丁氏培養(yǎng)基中加入一定量的孟加拉紅染料、鏈霉素能較好地選擇培養(yǎng)真菌；例3：YEM(甘露醇酵母粉培養(yǎng)基)加剛果紅或結(jié)晶紫可抑制G+細(xì)菌的生長。第78頁/共117頁第四節(jié)微生物的產(chǎn)能代謝

一、代謝的類型代謝(metabolism)是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)的總稱，由兩個(gè)過程組成。1分解代謝是指細(xì)胞將大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，并在這個(gè)過程中產(chǎn)生能量。2合成代謝是指細(xì)胞利用簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)合成復(fù)雜大分子的過程，在這個(gè)過程中要消耗能量。第79頁/共117頁分解代謝分為三個(gè)階段第一階段是將蛋白質(zhì)、多糖及脂類等大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解成氨基酸、單糖及脂肪酸等小分子物質(zhì)；第二階段是將第一階段產(chǎn)物進(jìn)一步降解成更為簡(jiǎn)單的乙酰輔酶A、丙酮酸以及能進(jìn)入三羧酸循環(huán)的某些中間產(chǎn)物，在這個(gè)階段會(huì)產(chǎn)生一些ATP、NADH及FADH2；第三階段是通過三羧酸循環(huán)將第二階段產(chǎn)物完全降解生成CO2，并產(chǎn)生ATP、NADH及FADH2。第80頁/共117頁第81頁/共117頁分解代謝和合成代謝的關(guān)系合成代謝所利用的小分子物質(zhì)源于分解代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。第82頁/共117頁二、生物氧化生物氧化:物質(zhì)在生物體內(nèi)經(jīng)過一系列連續(xù)的氧化還原反應(yīng)，逐步分解并釋放能量的過程，稱為生物氧化，是一個(gè)產(chǎn)能代謝過程。即分解代謝過程。

第83頁/共117頁1、生物氧化的含義及形式生物氧化是指有機(jī)分子在機(jī)體內(nèi)氧化分解成CO2和H2O并釋放出能量的過程。其形式包括底物與氧結(jié)合、脫氫或失去電子3種；其過程可分脫氫（或電子）、遞氫（或電子）受氫（或電子）3個(gè)階段。根據(jù)遞氫特別是受氫過程中氫受體性質(zhì)的不同，可以把生物氧化區(qū)分成有氧呼吸、無氧呼吸和發(fā)酵3種類型。第84頁/共117頁2、無氧呼吸

無氧呼吸又稱厭氧呼吸，是一類呼吸鏈末端的氫受體為外源無機(jī)氧化物（個(gè)別為有機(jī)氧化物）的生物氧化。第85頁/共117頁3、發(fā)酵在生物氧化或能量代謝中，發(fā)酵是指在無氧條件下，底物脫氧后所產(chǎn)生的還原力［H］不經(jīng)過呼吸鏈傳遞而直接交給某一內(nèi)源氧化性中間代謝產(chǎn)物的一類低效產(chǎn)能反應(yīng)。第86頁/共117頁（一）異養(yǎng)微生物的主要產(chǎn)能方式異養(yǎng)微生物氧化有機(jī)物的方式，根據(jù)氧化還原反應(yīng)中電子受體的不同可分成發(fā)酵呼吸有氧呼吸無氧呼吸

第87頁/共117頁第88頁/共117頁1、己糖的分解（糖酵解）生物體內(nèi)葡萄糖被降解成丙酮酸的過程稱為糖酵解(glycolysis)，主要分為四種途徑：EMP途徑、HMP途徑、ED途徑、磷酸解酮酶途徑。其中EMP途徑是最一般，是生物界所共有的，在微生物中廣泛存在于許多好氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌中。第89頁/共117頁EMP途徑(糖酵解途徑)第一階段：生成兩分子的主要中間代謝產(chǎn)物：甘油醛-3-磷酸。第二階段發(fā)生氧化還原反應(yīng)，合成ATP并形成兩分子的丙酮酸。EMP途徑可為微生物的生理活動(dòng)提供ATP和NADH，其中間產(chǎn)物又可為微生物的合成代謝提供碳骨架。

第90頁/共117頁HMP途徑（磷酸戊糖途徑，單磷酸己糖途徑）磷酸戊糖途徑可分為氧化階段和非氧化階段。一個(gè)HMP途徑循環(huán)的結(jié)果為：一般認(rèn)為HMP途徑不是產(chǎn)能途徑，而是為生物合成提供大量的還原力(NADPH)和中間代謝產(chǎn)物。第91頁/共117頁ED途徑一分子葡萄糖經(jīng)ED途徑最后生成兩分了丙酮酸、一分子ATP、—分子NADH和NADH。ED途徑可不依賴于EMP和HMP途徑而單獨(dú)存在，但對(duì)于靠底物水平磷酸化獲得ATP的厭氧菌而言，ED途徑不如EMP途徑經(jīng)濟(jì)。第92頁/共117頁磷酸解酮酶途徑磷酸解酮酶途徑是明串珠菌在進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵過程中分解己糖和戊糖的途徑。該途徑的特征性酶是磷酸解酮酶，根據(jù)解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的稱為PK途徑，把具有磷酸己糖解酮酶的叫HK途徑。

第93頁/共117頁2、丙酮酸代謝的多樣性

（1）發(fā)酵發(fā)酵(fermentation)是指微生物細(xì)胞將有機(jī)物氧化釋放的電子直接交給底物本身未完全氧化的某種中間產(chǎn)物，同時(shí)釋放能量并產(chǎn)生各種不同的代謝產(chǎn)物。(在發(fā)酵條件下有機(jī)化合物只是部分地被氧化，因此，只釋放出一小部分的能量。）發(fā)酵產(chǎn)能是厭氧和兼性好氧菌獲取能量的主要方式。發(fā)酵的種類有很多，可發(fā)酵的底物有糖類、有機(jī)酸、氨基酸等，其中以微生物發(fā)酵葡萄糖最為重要。第94頁/共117頁微生物發(fā)酵葡萄糖的形式乙醇發(fā)酵乳酸發(fā)酵

丙酸發(fā)酵

丁酸發(fā)酵

混合酸發(fā)酵先通過EMP途徑將葡萄糖分解為丙酮酸，然后由不同的酶系將丙酮酸轉(zhuǎn)化成不同的產(chǎn)物，如乳酸、乙酸、甲酸、乙醇、CO2和氫氣，

第95頁/共117頁2)呼吸作用微生物在降解底物的過程中，將釋放出的電子交給NAD(P)+、FAD或FMN等電子載體，再經(jīng)電子傳遞系統(tǒng)傳給外源電子受體，從而生成水或他還原型產(chǎn)物并釋放出能量的過程，稱為呼吸作用。

第96頁/共117頁Ⅰ、有氧呼吸在呼吸作用中，以分子氧作為最終電子受體的稱為有氧呼吸(aerobicrespiration)。在發(fā)酵過程中，葡萄糖經(jīng)過糖酵解作用形成的丙酮酸在厭氧條件下轉(zhuǎn)變成不同的發(fā)酵產(chǎn)物，而在有氧呼吸過程中，丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)(tricarboxylicacidcycle，簡(jiǎn)稱TCA循環(huán))，被徹底氧化生成CO2和水，同時(shí)釋放大量能量。第97頁/共117頁第98頁/共117頁II無氧呼吸

(anaerobicrespiration)：無氧呼吸的最終電子受體不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、CO2等這類外源受體。無氧呼吸也需要細(xì)胞色素等電子傳遞體，并在能量分級(jí)釋放過程中伴隨有磷酸化作用，生成的能量不如有氧呼吸產(chǎn)生的多。第99頁/共117頁反硝化作用（硝酸鹽呼吸或脫氮作用）：指反硝化細(xì)菌（兼性厭氧微生物）以硝酸鹽作為最終電子受體，NO3-還原成NO2-、N2O、N2等的過程（通常稱脫N作用）產(chǎn)生的條件：厭氧、有機(jī)質(zhì)、硝酸鹽；第100頁/共117頁在農(nóng)業(yè)和環(huán)境中的應(yīng)用：

不利：N素?fù)p失，污染環(huán)境；

有利：可消除水域中N素的富集；

第101頁/共117頁反硫化作用（硫酸鹽呼吸）反硫化細(xì)菌（嚴(yán)格厭氧菌，多數(shù)屬兼性營養(yǎng)型）以SO42-為最終電子受體，使SO42-還原成H2S的無氧呼吸類型

第102頁/共117頁沼氣發(fā)酵（甲烷形成）產(chǎn)甲烷細(xì)菌在厭氧條件下，利用H2還原CO2等碳源營養(yǎng)物以產(chǎn)生細(xì)胞物質(zhì)、能量和代謝廢物―CH4的過程。類經(jīng)CO2或重碳酸鹽作為呼吸鏈末端