微生物限標(biāo)準(zhǔn)

微生物限標(biāo)準(zhǔn)第1頁(yè)/共72頁(yè)

一、2005年版微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的控制項(xiàng)目

雜菌數(shù)：細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。控制菌（致病菌）：大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌。第2頁(yè)/共72頁(yè)

二、2005年版微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則2000年版：細(xì)菌數(shù)、酵母菌數(shù)和霉菌數(shù)按劑型制訂；控制菌（致病菌）按給藥途徑制訂。2005年版：均按給藥途徑制訂。制定原則：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑、及對(duì)患者健康潛在的危害而制訂的。修訂理由：同一劑型有不同的給藥途徑；新的劑型不斷出現(xiàn)；國(guó)外藥典的限度標(biāo)準(zhǔn)制訂原則統(tǒng)一。第3頁(yè)/共72頁(yè)三、2005年版微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用

本版藥典明確指出:藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過程中的檢驗(yàn)，原料及輔料(中藥提取物)的檢驗(yàn)，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂、進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核、考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。第4頁(yè)/共72頁(yè)四、2005年版微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的分類1.制劑通則、品種項(xiàng)下要求無菌的制劑及標(biāo)示無菌的制劑應(yīng)符合無菌檢查法規(guī)定。第5頁(yè)/共72頁(yè)2.口服給藥制劑

不含藥材原粉的制劑含藥材原粉的制劑*含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑*第6頁(yè)/共72頁(yè)3.局部給藥制劑

⑴用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重?fù)p傷的局部給藥制劑⑵用于表皮或黏膜不完整的含藥材原粉的局部給藥制劑

⑶用于表皮或黏膜完整的含藥材原粉的局部給藥制劑⑷眼部給藥制劑⑸耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑⑹陰道、尿道給藥制劑⑺直腸給藥制劑⑻其它局部給藥制劑第7頁(yè)/共72頁(yè)

含動(dòng)物組織（包括提取物)及動(dòng)物類原藥材（蜂蜜、王漿、動(dòng)物角、阿膠除外）的口服給藥制劑：每10g或10ml還不得檢出沙門。有兼用途徑的制劑，應(yīng)符合各給藥途徑的標(biāo)準(zhǔn)。霉變、長(zhǎng)螨者以不合格論。原料（中藥提取物）及敷料，參照相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。第8頁(yè)/共72頁(yè)五、2005版制劑通則項(xiàng)下的

微生物限度要求

第9頁(yè)/共72頁(yè)2005版化學(xué)藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求無菌檢查：注射劑、植入劑*、沖洗劑*。無菌檢查及微生物限度檢查：軟膏劑、乳膏劑*、糊劑*、眼用制劑、氣霧劑、噴霧劑、散劑、耳用制劑、鼻用制劑*、凝膠劑*、洗劑、灌腸劑*。

微生物限度檢查：局部用片劑*、酊劑*、栓劑*、糖漿劑*、膜劑*、粉霧劑、口服溶液劑、口服混懸劑、口服乳劑、搽劑、涂劑*、涂膜劑*、貼劑*。原則性要求：丸劑、口服片劑、膠囊劑、顆粒劑。第10頁(yè)/共72頁(yè)

新增的無菌檢查化學(xué)藥品制劑

鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷的鼻用制劑。

凝膠劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的凝膠劑。

乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。

第11頁(yè)/共72頁(yè)2005版中藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求無菌檢查：注射劑。無菌檢查及微生物限度檢查：散劑*、軟膏劑*、眼用制劑*、鼻用制劑*、氣霧劑*、噴霧劑*。微生物限度檢查：丸劑、顆粒劑、片劑、錠劑、煎膏劑、膠劑、糖漿劑、貼膏劑*、合劑、滴丸劑、膠囊劑、酒劑、酊劑、流浸膏劑、浸膏劑、凝膠劑*、露劑、茶劑、搽劑*、洗劑*、涂膜劑*、栓劑。不要求：膏藥第12頁(yè)/共72頁(yè)

新增的無菌檢查中藥制劑

散劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用散劑。

軟膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的軟膏劑。

眼用制劑：用于傷口的眼用制劑。

鼻用制劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的鼻用制劑。氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的氣霧劑、噴霧劑。

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2005版三部制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求

無菌檢查：注射劑、外用溶液劑、灌洗劑。微生物限度檢查：片劑*、栓劑、膠囊劑*、散劑、顆粒劑*、氣霧劑。

無菌檢查或微生物限度檢查：軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑、噴霧劑、眼用制劑、鼻用制劑。

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六、品種項(xiàng)下的微生物限度要求

敷料：乳糖、淀粉、糊精、玉米、精致玉米油等。

純化水：微生物限度檢查取本品，采用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄XIJ），細(xì)菌、霉菌、和酵母菌總數(shù)每1mL不得過100個(gè)。注射用水：微生物限度檢查取本品至少200mL，采用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄XIJ），細(xì)菌、霉菌、和酵母菌總數(shù)每100mL不得過10個(gè)。

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微生物限度檢查法

微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項(xiàng)目包括染菌量及控制菌檢查。

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起草的指導(dǎo)思想:

完善檢查法.

增加試驗(yàn)的可操作性.

使方法更具科學(xué)性，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性.微生物限度檢查法

第17頁(yè)/共72頁(yè)增、修訂內(nèi)容（1）-總則操作環(huán)境潔凈度：100級(jí)單向流空氣區(qū)域，環(huán)境10000級(jí)。定期檢測(cè):《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測(cè)試方法》。霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28℃。細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30～35℃。結(jié)果報(bào)告：以1g、1ml、10g、10ml

或10cm2為單位報(bào)告。第18頁(yè)/共72頁(yè)增、修訂內(nèi)容（2）-檢驗(yàn)量

隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍。貴重、微量樣品的檢驗(yàn)量可以酌減。

要求檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量應(yīng)增加10g或10ml。

第19頁(yè)/共72頁(yè)增、修訂內(nèi)容（3）-供試液制備

表面活性劑、中和劑或滅活劑：應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物的生長(zhǎng)和存活無影響。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。供試液的體積：100ml。非水溶性供試品：增加“十四烷酸異丙酯法”。結(jié)腸溶制劑供試品：用pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液溶解。第20頁(yè)/共72頁(yè)增、修訂內(nèi)容（4）——滅菌培養(yǎng)基及稀釋劑等滅菌:采用驗(yàn)證合格的滅菌程序進(jìn)行滅菌。第21頁(yè)/共72頁(yè)增、修訂內(nèi)容（5）——稀釋劑稀釋劑：pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液

pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液

pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液

第22頁(yè)/共72頁(yè)增、修訂內(nèi)容（6）-細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法。第23頁(yè)/共72頁(yè)

目的：增加試驗(yàn)方法的完整性、保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

何時(shí)驗(yàn)證：建立供試品的微生物限度檢查法時(shí)；供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。試驗(yàn)菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草桿菌。細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證⑴第24頁(yè)/共72頁(yè)細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證⑵菌液制備:50～100cfu/ml。驗(yàn)證方法：試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組。結(jié)果判斷：供試品組的菌回收率、對(duì)照組的菌回收率。均不低70%。第25頁(yè)/共72頁(yè)細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)-平皿法培養(yǎng)時(shí)間霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則第26頁(yè)/共72頁(yè)細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)-薄膜過濾法方法菌數(shù)報(bào)告規(guī)則第27頁(yè)/共72頁(yè)增、修訂內(nèi)容（7）-控制菌檢查沙門菌檢查法：用培養(yǎng)基直接制成供試液進(jìn)行增菌培養(yǎng)。大腸菌群檢查法梭菌檢查法第28頁(yè)/共72頁(yè)控制菌檢查法的驗(yàn)證目的：增加試驗(yàn)方法的完整性保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。何時(shí)驗(yàn)證：建立供試品的微生物限度檢查法時(shí)；供試品組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。試驗(yàn)菌株：按規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株。陰性菌對(duì)照菌株第29頁(yè)/共72頁(yè)控制菌檢查法的驗(yàn)證菌液制備:50～100cfu/ml。驗(yàn)證方法：試驗(yàn)組、陰性菌對(duì)照組。結(jié)果判斷：試驗(yàn)組應(yīng)檢出、陰性菌對(duì)照組不得檢出。第30頁(yè)/共72頁(yè)微生物限度檢查法

第31頁(yè)/共72頁(yè)檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量供試品。

第32頁(yè)/共72頁(yè)

除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；中藥膜劑為50cm2；化學(xué)膜劑為50cm2貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量應(yīng)增加10g或10ml。

第33頁(yè)/共72頁(yè)

供試液的制備

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。第34頁(yè)/共72頁(yè)

除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法1.液體供試品2.固體供試品3.特殊供試液制備方法（1）非水溶性供試品①司盤80②十四烷酸異丙酯第35頁(yè)/共72頁(yè)

（2）非水溶性膜劑供試品①腸溶及結(jié)腸溶供試品

②氣霧劑、噴霧劑供試品第36頁(yè)/共72頁(yè)

（3）具抑菌活性的供試品

當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除其抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法有：

①加大培養(yǎng)基量稀釋法②離心沉淀集菌法③薄膜過濾法④中和法第37頁(yè)/共72頁(yè)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證1、計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)該計(jì)數(shù)方法的可靠性。若供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)方法可靠性的再驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。

第38頁(yè)/共72頁(yè)

菌種

驗(yàn)證試驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。應(yīng)采用適宜的保存技術(shù)，防止試驗(yàn)菌株發(fā)生變異。第39頁(yè)/共72頁(yè)方法驗(yàn)證

CPBPUSPJP菌株大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠球菌黑曲霉大腸埃希菌金黃色葡萄球菌白色念珠球菌枯草芽孢桿菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠球菌黑曲霉大腸埃希菌金黃色葡萄球菌沙門菌加入菌量（cfu)50~100100105-106103檢驗(yàn)方法中和法平皿法稀釋法離心沉淀法薄膜過濾法中和法平皿法稀釋法薄膜過濾法中和法平皿法稀釋法薄膜過濾法平皿法稀釋法平板表面涂抹法薄膜過濾法第40頁(yè)/共72頁(yè)菌液制備用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含50~100cfu的菌懸液和50~100cfu的孢子懸液。菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度（℃）培養(yǎng)時(shí)間（h）大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠球菌黑曲霉?fàn)I養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基35~3723~2818~2424~485~7（天）第41頁(yè)/共72頁(yè)黑曲霉菌液的制備

新鮮培養(yǎng)的黑曲霉斜面中加入3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～00cfu的孢子懸液。第42頁(yè)/共72頁(yè)

驗(yàn)證方法

驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

⑴試驗(yàn)組：平皿計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，加入50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株菌平行制備2個(gè)平板，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌。

第43頁(yè)/共72頁(yè)

⑵菌液組：測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

⑶供試品對(duì)照組：測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

⑷稀釋劑對(duì)照組：若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時(shí)，用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50～100cfu。

第44頁(yè)/共72頁(yè)

結(jié)果判定

在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組、試驗(yàn)組的回收率均不低于70%，若任一次試驗(yàn)中回收率低于70%，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。

驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。

第45頁(yè)/共72頁(yè)檢查法

計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。

檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定。

取按已驗(yàn)證方法制備的均勻供試液或原藥液，用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液稀釋成1∶102、1∶103等稀釋級(jí)。

第46頁(yè)/共72頁(yè)

平皿法薄膜過濾法

陰性對(duì)照試驗(yàn)

培養(yǎng)和計(jì)數(shù)第47頁(yè)/共72頁(yè)控制菌檢查

控制菌檢查方法的驗(yàn)證

當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于供試品的控制菌檢查。若供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。

驗(yàn)證時(shí)，依各供試品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。

第48頁(yè)/共72頁(yè)菌液制備用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含10~100cfu的菌懸液菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度（℃）培養(yǎng)時(shí)間（h）大腸埃希菌金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌生孢梭菌營(yíng)養(yǎng)肉湯硫乙醇酸鹽流體35~3718~24第49頁(yè)/共72頁(yè)

驗(yàn)證方法

⑴試驗(yàn)組：取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，沖洗后，接入增菌培養(yǎng)基中。

第50頁(yè)/共72頁(yè)⑵陰性菌對(duì)照試組：設(shè)立陰性菌對(duì)照試是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性菌對(duì)照采用金黃色球菌，驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色球菌、梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不的檢出。

第51頁(yè)/共72頁(yè)結(jié)果判斷

陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行控制菌檢查；若試驗(yàn)組檢未出試驗(yàn)菌，應(yīng)采取有效方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。第52頁(yè)/共72頁(yè)結(jié)果判斷

1、供試品檢出控制菌或其它致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。

2、供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。

第53頁(yè)/共72頁(yè)3、眼用制劑檢出霉菌和酵母菌時(shí)，須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌，方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定。

4、若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。

第54頁(yè)/共72頁(yè)大腸埃希菌

CPBPUSPJP方法MUG法IMVICIMVICIMVIC檢驗(yàn)量（g或ml）1111稀釋劑pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液pH7.6磷酸鹽緩沖液pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液乳糖肉湯培養(yǎng)基乳糖液體培養(yǎng)基乳糖液體培養(yǎng)基預(yù)增菌+增菌膽鹽乳糖35~37℃18~24hMUG.5~24hMac肉湯43~45℃18~24h乳糖液體培養(yǎng)基35~37℃18~24hEC液體培養(yǎng)基45℃+-0.224h分離EMB瓊脂平版35~37℃18~24hMac瓊脂平版43~45℃18~24hEMB、Mca瓊脂平版35~37℃24~48hEMB瓊脂平版35℃24h生化試驗(yàn)++++第55頁(yè)/共72頁(yè)銅綠假單胞菌

CPBPUSPJP檢驗(yàn)量（g或ml）1110稀釋劑pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液pH7.6磷酸鹽緩沖液pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液pH7.2磷酸鹽緩沖液大豆蛋白消化培養(yǎng)基增菌膽鹽乳糖35~37℃18~24h大豆蛋白消化培養(yǎng)基35~37℃24h大豆蛋白消化培養(yǎng)基35~37℃24~484h分離溴化銨十六烷基三甲基瓊脂培養(yǎng)基35~37℃18~24h溴化銨十六烷基三甲基瓊脂培養(yǎng)基溴化銨十六烷基三甲基瓊脂培養(yǎng)基生化試驗(yàn)+++第56頁(yè)/共72頁(yè)金黃色葡萄球菌

CPBPUSPJP檢驗(yàn)量（g或ml）11101稀釋劑pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液pH7.6磷酸鹽緩沖液pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液大豆蛋白消化培養(yǎng)基SCD增菌營(yíng)養(yǎng)肉湯(或含亞碲酸鉀培養(yǎng)基35~37℃18~24h大豆蛋白消化培養(yǎng)基35~37℃24h大豆蛋白消化培養(yǎng)基35~37℃24~484hSCD30~35℃24~48h分離甘露醇氯化鈉瓊脂平板卵黃氯化鈉瓊脂平板35~37℃24~724hBP瓊脂平板35~37℃24~484h甘露醇氯化鈉瓊脂平板BP瓊脂平板35~37℃24~484h7.5%SCD瓊脂平板35~37℃24~484h凝固酶試驗(yàn)++++第57頁(yè)/共72頁(yè)沙門菌

CPBPUSPJP檢驗(yàn)量（g或ml）10101010稀釋劑乳糖肉湯培養(yǎng)基乳糖液體培養(yǎng)基乳糖液體培養(yǎng)基增菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基35~37℃18~24h乳糖肉湯培養(yǎng)基35~37℃5~24h乳糖液體培養(yǎng)基35~37℃24~48h乳糖液體培養(yǎng)基30~35℃24~72h二次增菌TTB液體培養(yǎng)基35~37℃18~24hTTB液體培養(yǎng)基42~43℃18~244hSC、TTB液體培養(yǎng)基35~37℃24~484hTTB液體培養(yǎng)基35~37℃12~24h分離EMB、MacDHL（或沙門、志賀菌屬瓊脂）平板35~37℃18~24hDC、XLD瓊脂平板43~45℃24~48hBG、XLD、BC瓊脂平板35~37℃24~48hXLD及亞硫酸鉍瓊脂平板、亮綠瓊脂平板、30~35℃24~48h生化試驗(yàn)++++第58頁(yè)/共72頁(yè)梭菌

檢驗(yàn)量（g或ml）10ml（相當(dāng)于供試品1g\ml)2份稀釋劑pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液增菌0.1%新鮮皰肉100ml0.1%新鮮皰肉100ml36±1℃80℃保溫10分鐘迅速冷卻72~96h36±1

℃72~96h分離含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板36±1℃

48~72h生化試驗(yàn)過氧化氫酶第59頁(yè)/共72頁(yè)梭菌的檢驗(yàn)程序

供試品→供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g、1ml)

↓80℃10min∣

迅速冷卻|

↓

↓

100ml0.1%皰肉培養(yǎng)基

↓

35~37℃厭氧72~96h

┌────────────┐

產(chǎn)氣、碎肉消化惡臭

不產(chǎn)氣、無消化碎肉，無惡臭↓0.2ml

涂抹

↓含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂平板35~37℃厭氧48~72h報(bào)告┌──────────┐有菌落生長(zhǎng)

無菌落生長(zhǎng)↓

↓過氧化氫酶試驗(yàn)，鏡檢

報(bào)告

┌──────────┐

過氧化氫酶陰性，革蘭陽性梭菌非左述反應(yīng)報(bào)告檢出報(bào)告未檢出第60頁(yè)/共72頁(yè)大腸菌群

方法

試管法檢驗(yàn)量（g或ml）0.1、0.01、0.001稀釋劑pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液增菌膽鹽乳糖10m3支分離EMB瓊脂（麥康凱瓊脂）平版確認(rèn)試驗(yàn)乳糖發(fā)酵大腸菌群最可能數(shù)第61頁(yè)/共72頁(yè)

大腸菌群檢查程序供試液

↓

10ml膽鹽乳糖發(fā)酵管

↓35~37℃18~24h

┌────────────┐

不產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣產(chǎn)酸、產(chǎn)氣

↓

↓大腸菌群陰性

曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板

↓或麥康凱瓊脂平板報(bào)告↓35~37℃18~24h

┌────────────┐

無典型菌落革蘭陰性無芽孢桿菌

↓

↓

報(bào)告

乳糖發(fā)酵管

↓

35~37℃18~24h

┌─────────┐

產(chǎn)氣不產(chǎn)氣↓↓大腸菌群陽性大腸菌群陰性↓↓報(bào)告