基因工程第二章基因工程的基本操作程序

基因工程第二章基因工程的基本操作程序第1頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四一.目的基因(TargetDNA)制備制備DNA片段可通過5個途徑：1、從生物基因組群體中分離目的基因2、人工合成3、PCR反應(yīng)合成DNA4、mRNA差異顯示法獲得目的基因5、機械的方法如超聲波把基因組打成片段目的基因是指準(zhǔn)備導(dǎo)入受體細胞的，以研究或應(yīng)用為目的所需要的外源基因。片段來源：原核生物和真核生物第2頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四1、從生物基因組群體中分離目的基因主要有以下幾種方法：限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法）mRNA或cDNA釣取法（反轉(zhuǎn)錄法）第3頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四A鳥槍法（霰彈法）美國塞萊拉遺傳公司創(chuàng)始人雷格·文特發(fā)明的，是20世紀(jì)最偉大的生物技術(shù)發(fā)明之一。鳥槍法是將基因組打成小片段進行測序，然后再利用計算機對這些片段進行排序和組裝，重新組裝成一個完整的基因組。鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性第4頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四

鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離第5頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四染色體的切斷與載體連接轉(zhuǎn)化受體細胞篩選含目的基因的重組子鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略第6頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四1、染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接,

但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，

目的基因完整第7頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四與載體連接如果采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體第8頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞轉(zhuǎn)化受體細胞篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）第9頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四鳥槍法操作的改進（一）使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA第10頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四鳥槍法操作的改進（二）例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接2.0kb1.6kb1.8kb在連接前將DNA片段進行分級分離第11頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四鳥槍法操作的改進凝膠DNA片段回收技術(shù)凍融法濾紙法吸附法低融點凝膠法溶解法第12頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第13頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四BcDNA法cDNA法克隆目的基因的基本方法cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性在核糖體合成多肽的旺盛時期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖體提取出來，分離出mRNA，然后以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成一個互補的DNA，即cDNA單鏈，再以此單鏈為模板合成出互補鏈，就成為雙鏈DNA分子。第14頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四提取細胞總mRNA，合成總cDNA第15頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA法克隆目的基因的基本方法mDNA（1）cDNA第一鏈的合成

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5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs第16頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四（2）cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)法置換合成法引導(dǎo)合成法第17頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA第二鏈的合成煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失第18頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH5‘ppp’5G

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3’3’T4-DNAligase置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失第19頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA第二鏈的合成

dCTPTdT5‘ppp’5G

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3’NaOH退火KlenowdNTPs引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列第20頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA法克隆目的基因的基本方法雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收第21頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序

提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等第22頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA法分離目的基因的基本程序特異分離程序

提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等第23頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序

利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學(xué)功能第24頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四差異分離程序

多瘤病毒感染的FR3T3細胞正常的FR3T3細胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達的基因cDNA克隆第25頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)

細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因

第26頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四CPCR法PCR(PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物PCR法定向擴增目的基因的基本原理第27頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四5‘5‘目的基因5‘變性加熱5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加熱變性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123第28頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四

由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR擴增產(chǎn)物T載體T7lacZMCSoriApr第29頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四D化學(xué)合成法化學(xué)合成法的基本方法化學(xué)合成的單元操作DNA化學(xué)合成的用途第30頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成法的基本方法全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：（1）小片段粘接法：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段混合退火T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

第31頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成法的基本方法全基因合成混合退火（2）補釘延長法：根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第32頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成法的基本方法全基因合成（3）大片段酶促法：混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第33頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成法的基本方法全基因合成

上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%第34頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補區(qū)域化學(xué)合成法的基本方法探針等寡聚核苷酸合成在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子。由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計時必須考慮下列問題:第35頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成法的基本方法探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列CysMetAspGluMetLysArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTCCGACGGCGTCGC設(shè)計的簡并探針序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGAAG此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設(shè)計expressedsequencetag第36頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成的單元操作

化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。從反應(yīng)機理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計的第37頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四化學(xué)合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂第38頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四DNA化學(xué)合成的用途合成天然基因修飾改造基因設(shè)計新型基因制備探針、引物、接頭如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等

第39頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四二．DNA片段與載體DNA體外重組外原基因（DNA片段）很難直接透過受體細胞的細胞膜進入受體細胞，即使進入，也會受到限制性內(nèi)切酶的作用而分解。要將外源基因?qū)胧荏w細胞，必須選擇適當(dāng)?shù)妮d體。第40頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四作為載體的DNA分子所具備的條件：1、容易進入寄主細胞2、進入寄主細胞后能夠獨立進行自主的復(fù)制和表達。3、容易從宿主細胞中分離純化常用的載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒和粘粒載體是外源基因進入受體細胞的工具。第41頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四DNA重組技術(shù)核心步驟：DNA片段的體外連接本質(zhì)：涉及限制酶，連接酶等酶促反應(yīng)過程載體：質(zhì)粒和溫和噬菌體需兩大酶：DNA限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶此外：DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA修飾酶、RNA修飾酶、核酸外切酶、堿性磷酸酶等第42頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四目的DNA片段被限制性內(nèi)切酶消化后其末端可能有3種形式：帶有相同的粘性末端帶有互補的粘性末端帶有平末端第43頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四(1)粘性末端的連接第44頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四(2)平末端的連接第45頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四三．DNA重組體轉(zhuǎn)入受體細胞1．受體細胞(特點)(1)轉(zhuǎn)化率高(2)保持質(zhì)粒穩(wěn)定(3)營養(yǎng)缺陷型(4)其他標(biāo)記不同的實驗?zāi)康模褂貌煌妮d體和受體細胞。第46頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四2．DNA重組體進入受體細胞人為地誘導(dǎo)大腸桿菌這樣的受體細胞進入感受態(tài)，主要采用兩種途徑(1)

化學(xué)處理(2)電擊法第47頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四四、目的基因的篩選和鑒定遺傳學(xué)方法插入滅活法(insertioninactivation):抗藥性標(biāo)志選擇標(biāo)志補救表達產(chǎn)物與營養(yǎng)缺陷互補

α-互補藍白斑篩選免疫學(xué)方法分子雜交探針原位雜交

PCR限制性酶切圖譜

第48頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四第49頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四第50頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四第51頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)第52頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四第53頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

第54頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四第55頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共66頁，2023年，2月20日，星期四表達系統(tǒng):表達外源基因的宿主細胞原核表達系統(tǒng):大腸桿菌真核表達系統(tǒng):酵母,昆蟲細胞,哺乳類動物細胞,植物細胞兩大類五、克隆基因的表達載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件；密