HepG2-HepG2.2.15內(nèi)的表達(dá)特征

HepG2/HepG2.2.15內(nèi)的表達(dá)特征【摘要】 【目的】 探討Toll 樣受體4(TLR4)在乙型肝炎組織及細(xì)胞株HepG2/內(nèi)的表達(dá)特征?！痉椒ā坎捎妹庖呓M化染色法檢測慢性乙型病毒性肝炎(CHB)63例、慢性重型肝炎(CSH)11例及健康對照組10例肝組織TLR4的表達(dá),綜合評分法判斷結(jié)果。常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2及,采用直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測TLR4在細(xì)胞上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)及陽性細(xì)胞率?！窘Y(jié)果】TLR4在慢性乙型病毒性肝炎及慢性重型肝炎患者肝組織上的表達(dá)明顯高于健康對照組(P<), 主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿及部分胞膜 ,在慢性乙型病毒性肝炎中,TLR4的表達(dá)強(qiáng)度與肝組織炎癥活動(dòng)度分級 (G)呈顯著正相關(guān)(r=,P<)。TLR4在肝癌細(xì)胞株上表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率分別為 ±、(±)%,明顯高于HepG2的±、(±)%(P<)?！窘Y(jié)論】TLR4的表達(dá)與乙型病毒性肝炎肝組織的炎癥活動(dòng)密切相關(guān),而乙型肝炎病毒可直接上調(diào)細(xì)胞TLR4的表達(dá),故TLR4參與了乙型病毒性肝炎發(fā)病過程中的免疫反應(yīng)并極有可能與免疫損傷有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】

TLR4;

乙型病毒性肝炎

;

免疫組化;

流式細(xì)胞術(shù)[J

SUNYat-senUniv(MedSci),

20XX,28(3):284-287]

目前認(rèn)為,乙型肝炎病毒侵入人體后

,免疫介導(dǎo)的肝損傷是乙型病毒性肝炎發(fā)病的主要機(jī)制。

Toll

樣受體(Toll-like

receptor,TLR),

是近年來發(fā)現(xiàn)的

I型跨膜蛋白質(zhì),已有

10余個(gè)家族成員

,它可通過識別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs),

引發(fā)信號傳導(dǎo)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放,在天然免疫防御中起重要作用,并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)。部分研究顯示,TLR4等在某些病毒感染的疾病過程中有重要作用。本研究通過檢測乙型病毒性肝炎患者肝組織,肝癌細(xì)胞株HepG2和細(xì)胞TLR4的表達(dá),探討TLR4與乙型病毒性肝炎的相關(guān)性。材料和方法研究對象標(biāo)本取自20XX年6月至20XX年2月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院部分住院病人共74例,男性69例,女性5例,平均年齡36(16~52)歲,其中慢性乙型病毒性肝炎組(chronic

viral

hepatitis

B,CHB)為肝穿刺標(biāo)本

,共

63例,慢性重型肝炎組(chronicseverehepatitis,CSH,

乙型)為肝移植病肝切除標(biāo)本

,11

例。另設(shè)健康對照組,標(biāo)本取自肝移植移植肝常規(guī)留取標(biāo)本,10例。均行常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片。診斷符合20XX年《慢性乙型肝炎防治指南》及20XX年《病毒性肝炎防治方案》[3,4]。方法肝組織病理切片的

TLR4表達(dá)檢測

采用

Elivision

二步法進(jìn)行免疫組化染色(Elivision 二步法試劑盒購自福州邁新公司 ),具體步驟參照試劑盒推薦步驟進(jìn)行,一抗為anti-TLR4PcAb(兔源性,美國SantaCruz公司),稀釋度為1∶100,DAB顯色,用檸檬酸高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù),設(shè)立陰性對照,以PBS代替一抗。診斷方法 所有病理切片均行

HE、狀纖維染色及

HBsAg、HBeAg免疫組化染色(SABC法)以輔助慢性乙型肝炎肝組織炎癥活動(dòng)度的分級(G)、纖維化程度的分期(S)的診斷,診斷標(biāo)準(zhǔn)參照20XX年《病毒性肝炎防治方案》。免疫組化結(jié)果的判斷 采用綜合評分法(由研究者及1名病理師分別閱片評分)。陽性著色呈棕色細(xì)顆粒狀。凡細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核淺棕色為1分、棕色為2分、深棕色為3分、不著色為0分;在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野,計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比,陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例:≤10%為0分,11%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,≥76%為4分。根據(jù)上述2項(xiàng)指標(biāo)的兩積分相乘分為4級:0分為陰性(-)、1~4分為弱陽性(+)、5~8分為中等陽性(++)、9~12分為強(qiáng)陽性(+++)。細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2及(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院傳染科實(shí)驗(yàn)室保存)培養(yǎng)液為含10%滅活新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司),細(xì)胞培養(yǎng)液另加G418,細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代,然后取對數(shù)生長細(xì)胞以104/mL接種于6孔板中,至細(xì)胞貼壁融合90%以上時(shí)每株各取4孔消化收集細(xì)胞,進(jìn)行TLR4表達(dá)檢測,以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。培養(yǎng)細(xì)胞的TLR4表達(dá)檢測 采用直接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)。2種細(xì)胞株各收集4管,DMEM懸浮細(xì)胞,1~5×106/mL。檢測前PBS洗滌細(xì)胞,分別加入PE-anti-TLR4抗體(美國Ebioscience公司)10μL和細(xì)胞100μL,設(shè)同型對照,以PE-mouseIgG2a(美國Ebioscience公司)10μL代替PE-anti-TLR4抗體,震蕩充分混勻,按常規(guī)方法室溫、避光孵育20min。以PBS常溫1000g離心5min洗滌1次后,以PBS配成約106/mL液,用FCM及Cellquest 軟件檢測并分析TLR4的平均熒光強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率 (采用BDFACSCalibur 流式細(xì)胞儀)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析,各組間的多重比較采用列聯(lián)表分析,兩組間計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),取?琢=。2 結(jié) 果TLR4在慢性乙型病毒性肝炎患者肝組織上的表達(dá)TLR4在CHB肝組織上主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿及部分胞膜上,細(xì)胞核及匯管區(qū)無表達(dá),與健康對照組相比,TLR4的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<,見圖1A~C),免疫組化染色強(qiáng)度與肝組織炎癥活動(dòng)度的分級(G)呈顯著正相關(guān)(r=,P<),除G3組與G4組之間無顯著性差異外,余各G組之間均有顯著性差異,