基因工程授課課件

基因工程基因工程：又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。一、DNA重組技術(shù)的基本工具準確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”）

——限制酶DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）

——DNA連接酶基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運輸車”）

——運載體1、限制酶

識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。

EcoRⅠ黏性末端黏性末端中心軸線兩側(cè)切開2.右圖為DNA分子結(jié)構(gòu)示意圖，對該圖的正確描述是A．④的名稱是胞嘧啶脫氧核苷酸B．解旋酶作用的部位是⑨C．某限制性核酸內(nèi)切酶可選擇⑨處作為切點D．DNA連接酶可連接⑩處斷裂的化學(xué)鍵BD磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲取（2）基因表達載體的構(gòu)建（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞（4）目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因；（3）通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成（一）從基因文庫中獲取目的基因1.什么叫基因文庫？將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，每個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蛭膸?/p>

基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因組文庫和部分基因文庫的比較小大某種生物的部分基因某種生物的全部基因基因組文庫和部分基因文庫的比較小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以（二）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——多聚酶鏈式反應(yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。PCR技術(shù)原理：前提：原料：方式DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n一段已知目的基因的核苷酸序列（模板DNA）DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）逆轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA雙鏈DNA（目的基因)化學(xué)合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因人工合成逆轉(zhuǎn)錄酶3、人工合成目的基因推測推測單鏈DNADNA聚合酶總結(jié)、目的基因主要是指_______________的結(jié)構(gòu)基因。獲得目的基因的常見方法有三種：（1）從基因文庫中獲取目的基因，根據(jù)基因的_________序列，基因在________上的位置，基因的________產(chǎn)物mRNA，基因的_______產(chǎn)物蛋白質(zhì)等獲取目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因，該技術(shù)是一項在________完成的核酸合成技術(shù)，前提條件是有一段已知目的基因的________序列，以便于合成_________。（3）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過____________方法。編碼蛋白質(zhì)核苷酸染色體轉(zhuǎn)錄表達體外核苷酸引物人工合成下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③D基因表達載體的作用：a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？二、基因表達載體的構(gòu)建——核心不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等；（5）有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。二、基因表達載體的構(gòu)建

目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。——基因工程的核心a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因e、復(fù)制原點表達載體啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶過程:注意：載體與表達載體的區(qū)別二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)使用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使其露出相同的黏性末端，再加入DNA連接酶。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞轉(zhuǎn)化目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上?；驑尫ǎ耗康幕?qū)雴巫尤~植物細胞花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎?、將目的基因?qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射轉(zhuǎn)基因受精卵轉(zhuǎn)基因動物3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎傥⑸镒魇荏w細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞吸收DNA表達載體與感受態(tài)細胞混合用Ca2＋處理，增加細菌細胞壁的通透性四、目的基因的檢測與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。2目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？不一定，需要檢測四、目的基因的檢測與鑒定青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因大腸桿菌1、鑒定——分子水平的鑒定（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因方法——DNA分子雜交技術(shù)DNA分子雜交技術(shù)1、鑒定——分子水平的鑒定方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA1、鑒定——分子水平的鑒定提?。?）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)2、鑒定——個體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。

（一）植物基因工程技術(shù)的應(yīng)用1、提高農(nóng)作物的抗逆能力

（1）抗蟲轉(zhuǎn)基因植物

三、基因工程的應(yīng)用（2）抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病轉(zhuǎn)基因植物所用的基因：①常用：病毒外殼蛋白基因和病毒的復(fù)制酶基因②抗真菌轉(zhuǎn)基因植物中有：幾丁質(zhì)酶基因和抗毒素合成基因（3）其它抗逆轉(zhuǎn)基因植物①抗鹽堿、干旱的基因：調(diào)節(jié)細胞滲透壓的基因②抗凍蛋白基因③抗除草劑基因2、改良農(nóng)作物的品質(zhì)富含賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米導(dǎo)入與植物花青素代謝有關(guān)的基因的矮牽牛3、利用植物生產(chǎn)藥物

二、動物基因工程前景廣闊（一）用于提高動物生長速度——動物品種改良、建立生物反應(yīng)器、器官移植等導(dǎo)入外源生長激素基因（二）用于改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)舉例說明將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大減低。（三）用轉(zhuǎn)基因的動物生產(chǎn)藥物設(shè)問:就基因藥物而言，最理想的表達場所是哪里？將藥物蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起，通過顯微注射等方法，導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中，將受精卵送入母體，使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物進入泌乳期后，可以通過分泌乳汁生產(chǎn)所需要的藥品，稱為乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。乳腺生物反應(yīng)器①獲取目的基因（例如血清白蛋白基因）②構(gòu)建基因表達載體（在血清白蛋白基因前加特異表達的啟動子）③顯微注射導(dǎo)入哺乳動物受精卵中④形成胚胎⑤將胚胎移植入母體動物⑥發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物（只有在產(chǎn)下的雌性個體的乳腺細胞中，轉(zhuǎn)入的基因才能特異表達）。思考:用基因工程技術(shù)實現(xiàn)動物乳腺生物反應(yīng)器的操作過程是怎樣的？膀胱生物反應(yīng)器目的基因在膀胱上皮細胞中特異性表達（四）用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體利用基因工程對豬的器官進行改造方法：將器官供體基因組導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子，以抑制抗原決定基因的表達或設(shè)法除去抗原決定基因，再結(jié)合克隆技術(shù)，培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官三、基因工程藥品異軍突起工程菌:用基因工程方法，使外源基因得到高效率表達的菌類細胞株系。四、基因治療曙光初照把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的，是治療遺傳病的最有效的手段。（把特定的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募毎?，從而達到治療疾病的目的）體外基因治療：先從病人體內(nèi)獲得某種細胞，進行培養(yǎng)，然后在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細胞擴增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)。體內(nèi)基因治療：直接向人體組織細胞中轉(zhuǎn)移的治病方法。（如將治療囊性纖維病的正?；蜣D(zhuǎn)入患者肺組織）DNA分子雜交是基因診斷最基本的方法之一。當(dāng)用一段已知基因的核苷酸序列作為探針，與被測基因進行接觸，若兩者的堿基完全配對成雙鏈，則表明被測基因中含有已知的基因序列?；蛟\斷五、基因芯片從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜；從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息?；蛐酒\斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。----DNA探針陣列蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)氨基酸序列多肽鏈基因DNA預(yù)期功能DNA合成分子設(shè)計mRNA生物功能轉(zhuǎn)錄翻譯折疊蛋白質(zhì)工程流程圖蛋白質(zhì)工程目標：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行分子設(shè)計。蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。即：通過修改基因來改變蛋白質(zhì)分子中的氨基酸，從而制造出具有新特征的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程以基因工程為基礎(chǔ)，是基因工程的應(yīng)用和延伸合成自然界不存在的蛋白質(zhì)天然存在的蛋白質(zhì)改造基因基因重組對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，對創(chuàng)造新的蛋白質(zhì)還未成功已被廣泛應(yīng)用蛋白質(zhì)工程與基因工程的異同都要改造基因，都屬于分子水平1、下列關(guān)于基因表達載體的敘述不正確的是A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼子B．啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C．標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達載體的構(gòu)建因受體細胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別A2、目前轉(zhuǎn)基因工程可以A.打破地理隔離但不能突破生殖隔離B.打破生殖隔離但不能突破地理隔離C.完全突破地理隔離和生殖隔離D.部分突破地理隔離和生殖隔離CA1、應(yīng)用基因工程技術(shù)診斷疾病的過程中必須使用基因探針才能達到檢測疾病的目的。這里的基因