細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)課件

細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)

一、過氧化物酶染色（POX)目的:了解過氧化物酶染色的原理、方法、注意事項(xiàng)和臨床意義。原理(四甲基聯(lián)苯胺法）:粒細(xì)胞和部分單核細(xì)胞的溶酶體顆粒中含有過氧化物酶(peroxidase,POX)，POX能將底物四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)氫離子傳遞給H2O2，使之氧化為四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)。四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)又可與亞硝基鐵氰化鈉結(jié)合，再進(jìn)一步氧化形成穩(wěn)定的藍(lán)色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)酶所在部位。若無亞硝基鐵氰化鈉，四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)則自我脫氫氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉著于酶所在部位。

取0.1％TMB乙醇溶液1ml，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10μl，溶液呈淡棕黃色。染色液應(yīng)在臨用前配制。在新鮮干燥的涂片上，加0.1％TMB-亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液的混合試劑0.5ml，放置1min后，再加稀過氧化氫溶液0.7ml，吹勻，染色6min。直接用流水沖洗，待干，再用瑞氏染液復(fù)染15～20min。流水沖洗后，待干，用油鏡鏡檢。結(jié)果判斷在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)黑色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性：無顆粒。弱陽性：顆粒小，分布稀疏。陽性：顆粒略粗，分布較密集。強(qiáng)陽性：顆粒粗大，密布于整個胞質(zhì)中。

方法步驟

注意事項(xiàng)

涂片應(yīng)新鮮制作、厚薄適宜。TMB配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果較好，勿用90％～95％乙醇，否則細(xì)胞表面蛋白質(zhì)很快凝固，妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而使顯色反應(yīng)減弱或消失。過氧化氫溶液需新鮮配制，其濃度與加入量不能隨意更改。涂片中粒細(xì)胞看不見陽性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，即表示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡，則示無效。染色液適宜pH值應(yīng)為5.5，若pH值<5.0會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。試劑應(yīng)置于低溫暗處，防止光線照射失效。染色時加稀過氧化氫溶液之后必須與染色液充分混勻，否則同一片子上細(xì)胞染色情況不一致。過碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)

目的:了解過碘酸-雪夫反應(yīng)的原理、方法、注意事項(xiàng)和臨床意義。原理:過碘酸-雪夫反應(yīng)(PeriodicacidSchiffreaction,PAS)又稱糖原染色，其原理為過碘酸可將細(xì)胞內(nèi)含有1,2-乙二醇基的糖類氧化而產(chǎn)生雙醛基，后者與雪夫(Schiff)染料作用，使無色品紅變?yōu)樽霞t色的化合物，定位于含有多糖類的胞質(zhì)中。根據(jù)胞質(zhì)中糖原種類及含量多少，可呈現(xiàn)粗細(xì)不等紅色顆粒、塊狀物或均勻紅色。

方法步驟

新鮮干燥的涂片用95％乙醇固定10min，流水沖洗，待干。加入10g/L過碘酸氧化15～20min，蒸餾水沖洗，待干。置雪夫染液中37℃(或室溫)染色30～60min。用亞硫酸溶液沖洗3次后，再用流水沖洗2～3min，待干。20g/L甲綠復(fù)染10～20min。

水洗，待干，鏡檢。

結(jié)果判斷：如在胞質(zhì)中出現(xiàn)彌散狀、顆粒狀或塊狀紅色為陽性。胞質(zhì)無色或無顆粒為糖原陰性。反應(yīng)強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

（1）中性粒細(xì)胞的分級標(biāo)準(zhǔn)：0分胞質(zhì)無色。1分胞質(zhì)內(nèi)呈淡紅色，有極少顆粒。2分胞質(zhì)呈紅色，厚而不透明，或有少量顆粒。3分胞質(zhì)呈深紅色，顆粒較緊密，但尚有空隙。4分胞質(zhì)呈深紫紅色，顆粒緊密，無空隙。（2）淋巴細(xì)胞分級標(biāo)準(zhǔn)：0分胞質(zhì)內(nèi)無色。1分胞質(zhì)內(nèi)呈彌散淡紅或有少數(shù)細(xì)顆粒(<10個)。2分胞質(zhì)內(nèi)呈彌散較深的紅色或有多數(shù)細(xì)顆粒(≥10個)。3分胞質(zhì)內(nèi)有較粗顆?；蛏贁?shù)小塊狀紅色物質(zhì)。4分胞質(zhì)內(nèi)呈多數(shù)粗顆粒并有大塊紅色物質(zhì)。

所用染色缸及器具應(yīng)十分清潔、干燥。雪夫(Schiff)染液應(yīng)避光密封冰箱保存，一般4℃下可保存6個月，試劑應(yīng)為無色，變紅則失效。10g/L過碘酸溶液質(zhì)量要保證，變黃則不能用。氧化時間要準(zhǔn)確，以20min為宜。染色時間和溫度應(yīng)相對恒定，一般以37℃染色30min最適宜。染色好的涂片應(yīng)及時檢查，以免褪色。偏重亞硫酸鈉易于分解，過碘酸易潮解，應(yīng)密封干燥保存。堿性品紅的質(zhì)量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。注意事項(xiàng)

紅血病、紅白血病及貧血類型的鑒別：紅血病、紅白血病、缺鐵性貧血、重型地中海貧血及骨髓增生異常綜合征時幼紅細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)；溶血性貧血、急慢性白血病、淋巴瘤時幼紅細(xì)胞呈陰性反應(yīng)或弱陽性反應(yīng)；再生障礙性貧血、巨幼細(xì)胞貧血時幼紅細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。白血病類型的鑒別