微生物學(xué)轉(zhuǎn)錄與基因表達(dá)調(diào)控

微生物學(xué)轉(zhuǎn)錄與基因表達(dá)調(diào)控第1頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

RNA的生物合成包括兩個(gè)方面：一是指以DNA為模板合成的RNA，稱為轉(zhuǎn)錄(transcripion)；另一方面是指在某些RNA病毒和高等動(dòng)物的特定組織中，以RNA為模板進(jìn)行的RNA的自我復(fù)制。以DNA為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式合成RNA的過(guò)程叫轉(zhuǎn)錄。體內(nèi)的RNA，包括mRNA、tRNA、rRNA和SnRNA，均是以DNA為模板，在RNA聚合酶催化下合成的。第2頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

轉(zhuǎn)錄復(fù)制

相同都以DNA為模板,合成方向都是5′→3′

之核苷酸之間都以磷酸二酯鍵相連處合成反應(yīng)都需要依賴DNA的聚合酶

模板

DNA的一條鏈(模板鏈)DNA的兩條鏈不原料

NTPdNTP

同配對(duì)

A-U,T-A,G-CA-T,G-C

之聚合酶

RNA聚合酶DNA聚合酶處產(chǎn)物

mRNA,tRNA,rRNA等子代DNA雙鏈

引物不需要需要第3頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA指導(dǎo)的RNA的合成一、轉(zhuǎn)錄的模板

轉(zhuǎn)錄以DNA為模板，但不是兩條DNA都能作模板。能轉(zhuǎn)錄出mRNA，然后指引蛋白質(zhì)合成的DNA，稱為結(jié)構(gòu)基因。其余DNA，可能轉(zhuǎn)錄成rRNA或tRNA，也可能是作為基因的調(diào)節(jié)部位。

DNA的兩條鏈中，只有一條可作為轉(zhuǎn)錄的模板，能作模板的一條稱為模板鏈(templatestrand)，又稱為負(fù)鏈；相對(duì)的一條稱為編碼鏈(codingstrand)或正鏈，所以除了以U代替T外，編碼鏈同轉(zhuǎn)錄出的RNA的序列是一致的。

第4頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

編碼鏈5′…GCATGGAATC…3′模板鏈3′…CGTACCTTAG…5′

轉(zhuǎn)錄

mRNA5′…GCAUGGAAUC…3′第5頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

模板鏈并不固定為DNA中的某一條。當(dāng)模板鏈位于同一DNA雙鏈的不同單鏈時(shí)，轉(zhuǎn)錄方向就相反，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄的方向總是5′→3′。

所以轉(zhuǎn)錄又稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。第6頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四二、RNA聚合酶

RNA聚合酶的全稱是依賴DNA的RNA聚合酶(DNA-directedRNApolymerase)，在有Mg2+、4種核苷三磷酸(dNTP)和DNA模板存在時(shí)，它能從新催化核苷酸聚合成與模板DNA互補(bǔ)的RNA長(zhǎng)鏈。

第7頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四說(shuō)明：

1.轉(zhuǎn)錄過(guò)程與DNA的復(fù)制相似，是前一個(gè)核苷酸核糖的3′-OH同核苷三磷酸的α-P發(fā)生親核反應(yīng)，脫下PPi，生成3′5′-磷酸二酯鍵；

2.轉(zhuǎn)錄出的第一個(gè)核苷酸通常是ATP或GTP，而且PPi會(huì)一直保留至轉(zhuǎn)錄完成后；

3.雖然RNA聚合酶可以從頭合成RNA，無(wú)需引物，但是是從DNA上稱為啟動(dòng)子的特定部位開(kāi)始的；

4.轉(zhuǎn)錄部位的模板DNA是解螺旋的，長(zhǎng)度有11個(gè)核苷酸，轉(zhuǎn)錄出的RNA和DNA模板形成一段8個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的RNA-DNA雜和體；第8頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第9頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

⒈原核生物的RNA聚合酶

大腸桿菌RNA聚合酶是由核心酶(coreenzyme)和σ因子組成的全酶，核心酶又是由5個(gè)亞基組成的α2ββ′ω蛋白質(zhì)。第10頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四E.coliRNA聚合酶的結(jié)構(gòu)示意圖第11頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

亞基功能α酶的組裝、啟動(dòng)子的識(shí)別、結(jié)合活性因子β與底物結(jié)合及磷酸二酯鍵的形成β′與模板結(jié)合σ決定起始位點(diǎn)的專一性E.coliRNA聚合酶各亞基的功能第12頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

⒉真核生物的RNA聚合酶

種類分布合成的RNA類型A(對(duì)α-鵝膏蕈堿不敏感)核仁rRNA(5.8S、18S、28S)B(對(duì)低濃度α-鵝膏蕈堿敏感)核質(zhì)hnRNA(mRNA的前體)和SnRNAC(對(duì)高濃度α-鵝膏蕈堿敏感)核質(zhì)tRNA和5SrRNA真核生物RNA聚合酶的種類和性質(zhì)第13頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、酶與模板的辨認(rèn)結(jié)合

原核生物的RNA聚合酶靠σ亞基的識(shí)別作用及其他亞基的相互配合，以全酶的形式結(jié)合到DNA的啟動(dòng)區(qū)上。

RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列稱為啟動(dòng)子(Promoters)。分析若干原核生物啟動(dòng)區(qū)的核苷酸序列后，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)部位，即-10bp區(qū)和-35bp區(qū)有保守性。

第14頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四E.coli的幾個(gè)啟動(dòng)子的序列第15頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

即在-35區(qū)，有保守序列5′-TTGACA-3′,它提供了RNA聚合酶的識(shí)別信號(hào)，所以與起始的辨認(rèn)有關(guān)。-10區(qū)有保守序列5′-TATAAT-3′,又稱為Pribnowbox，它與DNA雙鏈的解開(kāi)有關(guān)。保守序列的結(jié)構(gòu)是不對(duì)稱的，它決定了轉(zhuǎn)錄的方向，所以轉(zhuǎn)錄也是不對(duì)稱的。除了-10區(qū)和-35區(qū)外，在更上游的區(qū)域還有被稱為UPelement的強(qiáng)啟動(dòng)子，位于-40和-60之間，是RNA聚合酶的α-亞基識(shí)別的。在-60和-150之間，還有一個(gè)Fissite的區(qū)域，是轉(zhuǎn)錄起始因子Fis的結(jié)合位點(diǎn)，又稱為增強(qiáng)子。第16頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

真核生物結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子也有三個(gè)保守區(qū)，分別是：⑴-25bp~-30bp的7bp序列，稱為TATA框，或Hogness框，此序列幾乎全含A-T對(duì)，所以與DNA雙鏈的解開(kāi)和轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)有關(guān)，如果失去該框，轉(zhuǎn)錄可以從多個(gè)位點(diǎn)上開(kāi)始；⑵-75bp的9bp的不變序列GGT/CCAATCT，稱為CAAT框，它與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)；⑶更上游的GGGCGG序列，又稱為GC框，它是某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。第17頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四四、轉(zhuǎn)錄的起始(原核生物中)

轉(zhuǎn)錄過(guò)程從RNA聚合酶辨認(rèn)啟動(dòng)子、結(jié)合DNA模板開(kāi)始。⒈RNA聚合酶以全酶的形式辨認(rèn)DNA上的啟動(dòng)子，并結(jié)合在啟動(dòng)子的-35區(qū)域上。第18頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

⒉在解鏈酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶等的幫助下，DNA雙鏈在-10區(qū)解開(kāi)，形成轉(zhuǎn)錄空泡；第19頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四⒊在轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)上，兩個(gè)核苷三磷酸靠與模板相配對(duì)而直接被RNA聚合酶催化形成磷酸二酯鍵，第一個(gè)核苷三磷酸總是GTP或ATP，它們與第二個(gè)核苷三磷酸形成磷酸二酯鍵，但仍然保持三磷酸的狀態(tài)（pppA或pppG），作為RNA5′端的起始，形成〔RNA聚合酶全酶-DNA-pppPupN′-OH〕這一轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。⒋σ亞基從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上脫下來(lái)，核心酶則繼續(xù)結(jié)合于DNA分子上并沿DNA鏈向前移動(dòng)。第20頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

五、轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)

σ-亞基脫落后，全酶的構(gòu)象發(fā)生改變，與模板的結(jié)合變得更疏松，有利于RNA聚合酶在DNA上向前移動(dòng)。在移動(dòng)過(guò)程中：①RNA聚合酶覆蓋著解開(kāi)的DNA雙鏈和DNA-RNA雜化雙鏈的一部分，形成〔聚合酶核心酶-DNA-RNA]復(fù)合物；第21頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

②RNA大部分伸出在轉(zhuǎn)錄空泡之外，僅保留較短的新合成的RNA鏈與模板鏈互補(bǔ)結(jié)合，一旦聚合酶經(jīng)過(guò)之后，DNA又重新復(fù)合成雙螺旋。

第22頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

同一DNA分子上，可以有若干個(gè)RNA聚合酶同時(shí)轉(zhuǎn)錄，生成相應(yīng)的RNA鏈。第23頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

六、轉(zhuǎn)錄的終止

轉(zhuǎn)錄的終止是指RNA聚合酶在模板的某一位置(終止子)停頓，RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來(lái)的過(guò)程。終止的方式有兩種：

⒈依賴ρ因子的終止方式：

這種方式的DNA模板上，在靠近終止位點(diǎn)處有一段回文序列，轉(zhuǎn)錄的RNA可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ρ因子附著在新生的RNA鏈上，向RNA聚合酶移動(dòng)。當(dāng)RNA聚合酶在終止位點(diǎn)做短暫停留時(shí)，ρ因子就追上聚合酶，ATP的水解酶活性變成解鏈酶活性，使RNA-DNA雜化短鏈變性，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放出來(lái)。

第24頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止方式第25頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

⒉不依賴ρ因子的終止方式：在DNA模板鏈上，有如下的結(jié)構(gòu)協(xié)助轉(zhuǎn)錄的終止：①靠近終止位點(diǎn)處有富含A-T或G-C的特殊序列；②有回文結(jié)構(gòu)；③在模板鏈的終止位點(diǎn)末端有若干連續(xù)的AAAAA；轉(zhuǎn)錄出的RNA產(chǎn)物在終止子區(qū)域能形成徑環(huán)結(jié)構(gòu)，且3′端有連續(xù)的UUUUUU…。RNA形成徑環(huán)結(jié)構(gòu)，可以改變RNA聚合酶的構(gòu)象，導(dǎo)致酶不再往下游移動(dòng)，轉(zhuǎn)錄停頓，還可以使本來(lái)不穩(wěn)定的DNA-RNA雜化結(jié)構(gòu)更不穩(wěn)定；并且由于rU:dA是所有堿基配對(duì)中最不穩(wěn)定的，所以寡聚U則可以促使RNA新鏈從模板上脫下來(lái)。第26頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第27頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

第28頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四足跡法可以確定與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA的位點(diǎn)和序列。第29頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第30頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

RNA聚合酶在啟動(dòng)子上的結(jié)合第31頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

六、轉(zhuǎn)錄后的加工

轉(zhuǎn)錄生成的RNA稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(primarytranscript)，在原核生物和真核生物中都要經(jīng)過(guò)一定程度的加工、修飾，才能成為成熟的RNA，表現(xiàn)其功能，這個(gè)過(guò)程稱為RNA的成熟，或稱為轉(zhuǎn)錄后加工(Processing)。

㈠原核生物和真核生物中tRNA的加工

第32頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

tRNA的加工包括：⑴

RNaseP切出成熟的5′端；⑵RNaseF從3′切斷前體分子，再由外切酶RNaseD切出成熟的3′端。⑶在核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化下，由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸，在tRNA-3′加上CCA-OH。⑷核苷的修飾在tRNA甲基化酶的催化下，在特定位置(包括特定的序列)上將堿基甲基化，甲基供體是SAM。在tRNA假尿苷合成酶催化下，將特定位置上的U由N1-C1變?yōu)镃5-C1。㈠原核生物和真核生物中tRNA的加工

第33頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四splicing第34頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

(二）原核生物和真核生物中rRNA的加工原核生物的每個(gè)rRNA基因轉(zhuǎn)錄單位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA和tRNA組成，最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是30S，大約有6,500個(gè)核苷酸。之后各組分在相應(yīng)的核酸酶作用下，分別成熟。甲基化主要在堿基上進(jìn)行。真核細(xì)胞的rRNA基因?qū)儆诟叨戎貜?fù)序列DNA，重復(fù)序列之間被不能轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)分隔。不同種類生物的重復(fù)單位長(zhǎng)度及重復(fù)數(shù)均不同，但轉(zhuǎn)錄出的rRNA的大小卻是相同的。甲基化主要在核糖的2′-OH上。第35頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四原核生物rRNA的加工過(guò)程第36頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四真核生物rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工第37頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

⒈原核生物mRNA的加工

原核生物中的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯沒(méi)有區(qū)間的限制，轉(zhuǎn)錄和翻譯可以同時(shí)進(jìn)行，所以大多數(shù)mRNA不需要加工。而且原核mRNA不穩(wěn)定，通常只能存在幾分鐘，隨即被從5′端開(kāi)始降解。(三)mRNA的加工第38頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

原核生物的mRNA在被轉(zhuǎn)錄的同時(shí)就可以做翻譯的模板。第39頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

2.真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工⑴5′端的修飾：

mRNA5′端的帽子結(jié)構(gòu)是在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，先于剪接過(guò)程而形成的。反應(yīng)過(guò)程是：

5′pppG/A-------↓磷酸酶

5′ppG/A-----+Pi↓+pppG5′G5ppp5G/A------+PPi↓甲基化酶

5′m7G5ppp5G/A------

SAM第40頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四NH2O型和Ⅰ型帽子結(jié)構(gòu)第41頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四NH2Ⅱ型帽子結(jié)構(gòu)第42頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

Thecapprovides:

⑴protectionofthemRNA;⑵enhancementofthemRNA’stranslatability;⑶transportofthemRNAoutofthenucleus;⑷propersplicingofthepre-mRNA.第43頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

⑵3′端的修飾

即在3′端加上多聚酰苷酸polyAtail。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，先由核酸外切酶切去3′過(guò)剩的核苷酸，再由多聚酰苷酸聚合酶催化，接上約20-250個(gè)腺苷酸組成的polyA。在多聚酰苷酸化位置的上游約11~30個(gè)核苷酸處有一保守序列AATAAA，之后是一段富含GU的結(jié)構(gòu)，這些被認(rèn)為是多聚酰苷酸化的識(shí)別信號(hào)。第44頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

在mRNA前體上加上多聚腺苷酸的過(guò)程第45頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

polyA的功能：①幫助mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)；②維持mRNA作為翻譯模板的活性，隨著polyA的降解，翻譯的活性下降。只有極少數(shù)真核基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無(wú)polyA，如組蛋白基因。第46頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

⑶mRNA的剪接

核酸雜交實(shí)驗(yàn)證明，mRNA的前體hnRNA能同DNA模板鏈完全配對(duì)，而mRNA同DNA和hnRNA雜交時(shí)，都只有部分區(qū)域配對(duì)，中間有呈泡狀突出的區(qū)段。

第47頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雞卵清白蛋白基因中的外顯子(extron)和內(nèi)含子(intron)第48頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第49頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

內(nèi)含子的種類及拼接機(jī)制：第一類內(nèi)含子：存在于細(xì)胞核、線粒體和葉綠體中rRNA的前體中；拼接過(guò)程中的第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)第50頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第一類內(nèi)含子的拼接過(guò)程

(親核試劑是外界的G)第51頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

第二類內(nèi)含子：存在于線粒體和葉綠體的mRNA的前體中；(親核試劑是內(nèi)含子內(nèi)部特定位點(diǎn)上的A-2′-OH)

這兩類內(nèi)含子的拼接過(guò)程均無(wú)需蛋白質(zhì)的參與，所以屬于“自我拼接(selfsplicing)”。第52頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期四這兩類內(nèi)含子的拼接過(guò)程均無(wú)需蛋白質(zhì)的參與，RNA分子本身具有酶的活性，發(fā)揮催化拼接的作用，這種由RNA發(fā)揮作用的酶稱為核酶(ribozyme)，反應(yīng)的過(guò)程屬于自我拼接(selfsplicing)。現(xiàn)已知道，某些病毒、噬菌體RNA，以及RN