微生物的生理生化反應(yīng)

微生物的生理生化反應(yīng)第1頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四微生物的生理生化反應(yīng)大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、

V.P.反應(yīng)(乙酰甲基甲醇反應(yīng))第2頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四淀粉的水解試驗(yàn)

一、目的要求

二、實(shí)驗(yàn)原理

三、器材

四、操作步驟

五、結(jié)果

第3頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四一、目的要求

證明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。掌握微生物大分子水解試驗(yàn)的原理和方法。第4頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四二、基本原理

微生物對大分子的淀粉不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）將大分子物質(zhì)的分解過程可以通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實(shí)。淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍(lán)色，但細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測定不再產(chǎn)生藍(lán)色，表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶。第5頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四三、器材

菌種：枯草芽孢桿菌，大腸桿菌（金黃色葡萄球菌）。培養(yǎng)基：固體淀粉培養(yǎng)基。溶液或試劑：盧戈氏碘液。儀器或其他用具：無菌平板，無菌試管，接種環(huán)，接種針，試管架。第6頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四四、操作步驟

（1）將固定淀粉培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃左右，無菌操作制成平板。（2）用記號筆在平板底部劃成二部分。（3）將枯草芽孢桿菌,大腸桿菌（金黃色葡萄球菌）分別在不同的部分劃線接種，在平板的反面分別寫上菌名。（4）將平板倒置在37℃溫箱中培養(yǎng)24h。（5）觀察各種細(xì)菌的生長情況,將平板打開蓋子,滴入少量盧戈氏碘液于平皿中,輕輕旋轉(zhuǎn)平板,使碘液均勻鋪滿整個平板。第7頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四五、實(shí)驗(yàn)報告

1.結(jié)果將結(jié)果填入下表?！埃北硎娟栃?，“－”表示陰性。菌名枯草芽孢桿菌大腸桿菌金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌淀粉水解實(shí)驗(yàn)第8頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四2.思考題不利用碘液，你怎么證明淀粉水解的存在?第9頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四糖發(fā)酵試驗(yàn)

一、目的要求

二、實(shí)驗(yàn)原理

三、器材

四、操作步驟

五、結(jié)果

第10頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四一、目的要求1.了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用。

2.掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。第11頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四二、基本原理糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)。某些細(xì)菌能利用糖類作為碳源和能源，使糖類分解而產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不同種的細(xì)菌對于各種糖類利用能力不同，分解產(chǎn)物也不同。大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；普通變形桿菌只能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖。第12頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四二、基本原理酸的產(chǎn)生可利用指示劑:溴甲酚紫

pH6.8呈紫色，pH5.2呈黃色氣體產(chǎn)生：德漢氏小管第13頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四

產(chǎn)酸指示劑、倒置小管第14頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四

三、器材

1.菌種：大腸桿菌，普通變形桿菌斜面各一支。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管各3支（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管）。

3.儀器或其他用具：試管架，接種環(huán)等。第15頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四四、操作步驟1.用記號筆在各試管外壁上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的細(xì)菌菌名。2.取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，分別接入大腸桿菌，普通變形桿菌，第三支不接種，作為對照。另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，同樣分別接入大腸桿菌，普通變形桿菌，第三支不接種，作為對照。第16頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四在接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。

3.將接種過和作為對照的6支試管均置37℃培養(yǎng)24～48h。

4.觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。第17頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四五.實(shí)驗(yàn)報告1.結(jié)果將結(jié)果填入下表?！?”表示產(chǎn)酸或產(chǎn)氣，“-”表示不產(chǎn)酸或不產(chǎn)氣。

糖類發(fā)酵大腸桿菌普通變形桿菌對照葡萄糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵第18頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四

2.思考題假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？第19頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)與V.P.反應(yīng)吲哚試驗(yàn)（indoltest）甲基紅試驗(yàn)（methylredtest）V.P.反應(yīng)（Voges-Prokauertest）第20頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四一、目的要求了解試驗(yàn)原理及其在腸道菌鑒定中的意義和方法。第21頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四二、基本原理吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、伏-普試驗(yàn)主要用來鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）。主要是用于水的細(xì)菌學(xué)檢查，因?yàn)榇竽c桿菌雖非致病菌，但在飲水中若大腸桿菌超過一定數(shù)量則表示受糞便污染；而產(chǎn)氣腸桿菌則廣泛存在于自然界中，因此，檢查水時要將二者區(qū)分開來。第22頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，就會形成紅色的玫瑰吲哚。色氨酸水解反應(yīng)吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。吲哚試驗(yàn)第23頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四某些細(xì)菌在糖代謝過程中，將培養(yǎng)基中的糖分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基變酸，加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑[pH4.2（紅色）-6.3（黃色）]，可使培養(yǎng)基由原來的桔黃色變?yōu)榧t色，即甲基紅陽性反應(yīng)。大腸桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸;產(chǎn)氣腸桿菌將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為非酸性末端產(chǎn)物,如乙醇、丙酮酸等。甲基紅試驗(yàn)第25頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四伏-普試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)行縮合，脫羧變成乙酰甲基甲醇，此物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應(yīng)陽性，沒有紅色化合物產(chǎn)生則為陰性。其反應(yīng)過程如下：

產(chǎn)氣腸桿菌伏-普反應(yīng)陽性，大腸桿菌伏-普為陰性。第26頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四第27頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四三、器材菌種

大腸桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌；培養(yǎng)基

蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；溶液或試劑

甲基紅試劑，40％KOH，5％α-萘酚，乙醚，吲哚試劑等。第28頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四四、操作步驟1．接種與培養(yǎng)

(1)將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于2支蛋白胨水培養(yǎng)基中（做吲哚試驗(yàn)），置37℃溫室中培養(yǎng)2天。

(2)將上述二菌分別接種于2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中（做甲基紅試驗(yàn)與伏-普試驗(yàn)），置37℃溫室培養(yǎng)2天。第29頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四2．觀察結(jié)果

(1)吲哚試驗(yàn)于培養(yǎng)48小時后的蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加3—4滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1—3分鐘，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚試劑，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應(yīng)。第30頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四(2)甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)48小時后，將葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物分為兩小管（其中一管留做伏-普試驗(yàn)），在一管內(nèi)加甲基紅試劑2滴，培養(yǎng)基變紅色者為陽性，黃色者為陰性。第31頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四(3)伏—普試驗(yàn)培養(yǎng)兩天后，將另一支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入5～10滴40％KOH，然后加入等量的5％α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃溫箱中保溫15～30min，以加快反應(yīng)速度。培養(yǎng)物呈紅色者，為陽性。第32頁，共34頁，2023年，2月20日，星期四

五、實(shí)驗(yàn)報告

1．結(jié)果將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表。“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。菌名吲哚試驗(yàn)甲基紅實(shí)驗(yàn)伏—普試驗(yàn)