第5章免疫血清學檢驗技術

第一節(jié)凝集與沉淀反應第二節(jié)放射免疫測定技術第三節(jié)免疫熒光技術第四節(jié)酶免疫測定第五節(jié)固相膜免疫測定現(xiàn)在是1頁\一共有102頁\編輯于星期四凝集反應：細菌、螺旋體、紅細胞或細胞性抗原等顆粒性抗原，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結合成致敏顆粒后，它們與相應抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應，在適當電解質存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。一、凝集反應及其特點第一節(jié)凝集與沉淀反應現(xiàn)在是2頁\一共有102頁\編輯于星期四凝集反應過程：抗原抗體的特異性結合出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象凝集反應特點：IgM的作用比IgG大數(shù)百倍IgG與抗原結合后，常不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稱不完全抗體臨床意義：進行細菌的抗原分析、鑒定及分型，也可應用已知細菌檢查未知血清的抗體?，F(xiàn)在是3頁\一共有102頁\編輯于星期四多克隆抗體單克隆抗體肌紅蛋白上清液現(xiàn)在是4頁\一共有102頁\編輯于星期四肉眼可見的凝集現(xiàn)象現(xiàn)在是5頁\一共有102頁\編輯于星期四直接凝集反應(directagglutination)：

顆粒性抗原直接與抗體結合，在電解質的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。二、直接凝集反應現(xiàn)在是6頁\一共有102頁\編輯于星期四（一）玻片凝集試驗YYY+方法評價:定性試驗簡便和快速敏感度低臨床應用:菌種鑒定血清學分型血型鑒定現(xiàn)在是7頁\一共有102頁\編輯于星期四（二）試管凝集試驗方法評價：半定量試驗簡便、快速敏感度低可有假陽性臨床應用：肥達氏試驗：傷寒副傷寒外裴二氏試驗：斑疹傷寒Wrighttest:布魯菌病交叉配血試驗現(xiàn)在是8頁\一共有102頁\編輯于星期四間接凝集反應(indirectagglutination)：

將可溶性抗原或抗體吸附于顆粒性載體表面，然后與相應的抗體或抗原反應，在電解質的作用下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。載體種類：RBC（醛化）；聚苯乙烯膠乳顆粒（羧化）；金黃色葡萄球菌。三、間接凝集反應現(xiàn)在是9頁\一共有102頁\編輯于星期四用抗原致敏載體--檢測抗體（一）間接凝集反應的類型1、正向間接凝集試驗現(xiàn)在是10頁\一共有102頁\編輯于星期四用抗體致敏載體----檢測抗原2、反向間接凝集試驗現(xiàn)在是11頁\一共有102頁\編輯于星期四用抗原致敏載體--檢測抗原3、間接凝集抑制試驗現(xiàn)在是12頁\一共有102頁\編輯于星期四coagglutinationtest：以金黃色葡萄球菌菌體為反應的載體。人及多種哺乳動物（豬、兔、豚鼠等）血清中IgG抗體的FC段與菌體表面的A蛋白（SPA）非特異性結合后，IgG的兩個Fab段仍然暴露在菌體表面，保持著結合抗原的活性和特異性。當與特異性抗原相遇時，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。SPA--(Fc)IgG(Fab)--AbSPA：staphylococcalproteinA4、協(xié)同凝集試驗現(xiàn)在是13頁\一共有102頁\編輯于星期四（二）正向間接血凝試驗血凝試驗強度現(xiàn)在是14頁\一共有102頁\編輯于星期四1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512<232128324Patient12345678正向間接血凝試驗現(xiàn)在是15頁\一共有102頁\編輯于星期四（三）反向膠乳凝集試驗現(xiàn)在是16頁\一共有102頁\編輯于星期四將病毒抗原或重組抗原吸附于粉紅色明膠顆粒上，當致敏顆粒與樣品血清作用時，若血清含有抗病毒抗體則可形成肉眼可見的粉紅色凝集（四）明膠凝集試驗現(xiàn)在是17頁\一共有102頁\編輯于星期四抗原的檢測反向間接凝集試驗可用于檢測病原體的可溶性抗原，也可用于檢測各種蛋白質成分?？贵w的檢測檢測細菌、病毒、寄生蟲等感染后產生的抗體。（五）間接凝集反應的應用現(xiàn)在是18頁\一共有102頁\編輯于星期四未經致敏的受檢者新鮮紅細胞試劑：抗人O型紅細胞的單克隆抗體臨床應用：HIV檢測、HBV檢測四、自身紅細胞凝集試驗現(xiàn)在是19頁\一共有102頁\編輯于星期四五、抗球蛋白試驗（Coombs試驗）現(xiàn)在是20頁\一共有102頁\編輯于星期四（一）直接Coombs試驗檢測紅細胞上的不完全抗體現(xiàn)在是21頁\一共有102頁\編輯于星期四（二）間接Coombs試驗檢測血清中的不完全抗體現(xiàn)在是22頁\一共有102頁\編輯于星期四可溶性抗原(如細菌、外毒素、血清蛋白等)與相應抗體特異性結合后，在一定條件(適量的電解質、合適的酸堿度和溫度)下，經一定時間，于比例合適處形成肉眼可見的沉淀現(xiàn)象。六、沉淀反應precipitationreaction現(xiàn)在是23頁\一共有102頁\編輯于星期四沉淀反應液體內沉淀反應凝膠沉淀反應環(huán)狀沉淀反應絮狀沉淀反應免疫濁度測定瓊脂擴散試驗免疫電泳雙向瓊脂擴散試驗單向瓊脂擴散試驗對流免疫電泳試驗現(xiàn)在是24頁\一共有102頁\編輯于星期四（一）單向瓊脂擴散試驗制成含有適宜抗體濃度的瓊脂凝膠板。以適當距離打孔，孔中加入可溶性抗原?？乖蛑車鷶U散，當抗原與抗體比例適宜時，在瓊脂中形成抗原－抗體復合物的晶格和沉淀。沉淀環(huán)的直徑與抗原濃度呈正相關。擴散圈出現(xiàn)呈兩重沉淀環(huán)的雙環(huán)現(xiàn)象，表明存在但抗原性相同，而擴散率不同的兩種組分?，F(xiàn)在是25頁\一共有102頁\編輯于星期四大分子抗原和長時間擴散（＞48h）：C=k×d2小分子抗原和較短時間（24h）：logC=k×d現(xiàn)在是26頁\一共有102頁\編輯于星期四（二）雙向瓊脂擴散試驗可溶性抗原與相應抗體在含適量電解質的瓊脂凝膠板的對應孔中，各自向四周擴散，若兩者分子比例適當，則在擴散的一定時間后在兩孔之間相遇并生成白色沉淀線。現(xiàn)在是27頁\一共有102頁\編輯于星期四現(xiàn)在是28頁\一共有102頁\編輯于星期四加入定量的抗體在中間孔，按一定距離在四周打數(shù)個小孔，分別加入不同稀釋度的抗原可見粗細不等的沉淀線，從而可判定抗原的效價?，F(xiàn)在是29頁\一共有102頁\編輯于星期四三孔型雙向免疫擴散可能的結果現(xiàn)在是30頁\一共有102頁\編輯于星期四（三）對流免疫電泳試驗概念:

在電場中進行的雙向免疫擴散。原理:

將抗原加至近陰極孔內，抗體加至近陽極孔內?？乖c抗體在pH8.6的緩沖液中均帶負電荷，通電后，抗原因帶負電荷向陽極泳動，而抗體球蛋白等電點高，所帶負電荷少，加之分子量較大，向陽極的位移小于受電滲作用向陰極的位移，形成抗原抗體相向移動。二者結合，在比例適宜處形成白色沉淀線。優(yōu)點:

快速，只需1小時左右；靈敏度提高，約為10μg／ml?，F(xiàn)在是31頁\一共有102頁\編輯于星期四現(xiàn)在是32頁\一共有102頁\編輯于星期四（四）火箭電泳RocketElectrophoresis

又稱免疫擴散，是把單向免疫擴散同電泳結合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點是需時較短，故可用于快速沉淀標本中抗原的含量?，F(xiàn)在是33頁\一共有102頁\編輯于星期四火箭電泳示意圖現(xiàn)在是34頁\一共有102頁\編輯于星期四早期的放射免疫技術是基于競爭性結合反應原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又發(fā)展了非競爭性結合的免疫放射分析(IRMA)。該類技術具有靈敏度高、特異性強、重復性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標準化等優(yōu)點，廣泛應用于生物醫(yī)學研究和臨床診斷領域中各種微量蛋白質、激素、小分子藥物和腫瘤標志物的定量分析。第二節(jié)放射免疫測定技術現(xiàn)在是35頁\一共有102頁\編輯于星期四常用標記核素

125I3H射線類型γβ理化性活潑不活撥核素豐度>90%-半衰期60.2d12.3y標記方法簡單復雜標記設備低廉昂貴測量條件簡單復雜現(xiàn)在是36頁\一共有102頁\編輯于星期四一、放射免疫分析1、基本原理：Ab限量，Ag*定量，Ag*與Ag具有等同的與Ab結合能力，且兩者的總量大于Ab結合位點，二者通過競爭方式與Ab結合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結合形成Ag*Ab復合物的放射量降低，二者變化成函數(shù)關系?，F(xiàn)在是37頁\一共有102頁\編輯于星期四現(xiàn)在是38頁\一共有102頁\編輯于星期四以未結合的Ag*為F，Ag*-Ab復合物為B，則B/F或B/T(B＋F)與Ag的量變存在著劑量-反應曲線?，F(xiàn)在是39頁\一共有102頁\編輯于星期四2、實驗方法及測定Ag*Ag平衡非平衡一步法二步法Ab＋體積溫度時間pHAg*--標準；Ag--樣品現(xiàn)在是40頁\一共有102頁\編輯于星期四二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應平衡效果不受反應介質影響操作應簡單、重復性好經濟結合與游離標記物的分離現(xiàn)在是41頁\一共有102頁\編輯于星期四二、免疫放射分析1、基本原理：以過量125I標記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結合反應,用固相免疫吸附劑對B或F進行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡單?，F(xiàn)在是42頁\一共有102頁\編輯于星期四2、單位點IRMA先用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物；用固相抗原結合游離的標記抗體并將其分離,測定上清液的放射量現(xiàn)在是43頁\一共有102頁\編輯于星期四3、雙位點IRMA先用固相抗體與抗原結合，再用過量的標記抗體與抗原的另一決定簇結合，形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物，洗棄剩余標記抗體，測固相上放射性?，F(xiàn)在是44頁\一共有102頁\編輯于星期四RIAIRMA標記物抗原抗體原理競爭性結合非競爭結合反應體系Ag*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反應動力學慢快靈敏度相對低高檢測范圍窄寬1-2數(shù)量級特異性差（PcAb）優(yōu)（McAb）標準曲線結合率與測值成反比結合率與測值成正比待測抗原大小分子二抗原決定簇IRMA與RIA比較現(xiàn)在是45頁\一共有102頁\編輯于星期四

將抗原抗體反應與熒光物質發(fā)光分析相結合，用熒光檢測儀檢測抗原抗體復合物中特異性熒光強度，對液體標本中微量或超微量物質進行定量測定。第三節(jié)熒光免疫技術（一）熒光免疫分析的基本原理現(xiàn)在是46頁\一共有102頁\編輯于星期四均相熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定熒光酶免疫測定非均相熒光免疫測定熒光偏振免疫測定熒光免疫技術熒光免疫技術的類型熒光免疫測定液體樣品測定熒光抗體技術固體樣品測定直接法間接法雙標記法現(xiàn)在是47頁\一共有102頁\編輯于星期四熒光物質λex（nm）λem（nm）應用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495520～530（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575595～600（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550620（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490-560595（紅色）雙標記FAT、流式細胞術7-氨基-4-甲基香豆素354430（藍色）雙標記或多標記FATEu3+螯合物340613時間分辨熒光免疫測定熒光免疫測定中常用的熒光物質現(xiàn)在是48頁\一共有102頁\編輯于星期四時間分辨檢測原理示意圖（二）時間分辨熒光免疫測定1、基本原理現(xiàn)在是49頁\一共有102頁\編輯于星期四鑭系元素銪(Eu3+)（最常用）；釤(Sm3+)；鋱(Tb3+)；釹(Nd3+)；鏑(Dy3+)熒光物質熒光壽命(ns)熒光物質熒光壽命(ns)非特異熒光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000細胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA10002、標記物常見熒光物質的熒光壽命現(xiàn)在是50頁\一共有102頁\編輯于星期四3、信號增強作用結合β-二酮體Eu3+解離pH<4熒光增強Eu3+標記的抗原-抗體復合物固相雙抗體夾心法原理示意圖現(xiàn)在是51頁\一共有102頁\編輯于星期四固相抗體-待檢抗原-Eu3+標記抗體復合物在酸性增強液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。4、雙抗體夾心法現(xiàn)在是52頁\一共有102頁\編輯于星期四待檢抗原和Eu3+標記抗原與固相抗體競爭結合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。5、固相抗體競爭法現(xiàn)在是53頁\一共有102頁\編輯于星期四待檢抗原和固相抗原競爭結合定量的Eu3+標記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。6、固相抗原競爭法現(xiàn)在是54頁\一共有102頁\編輯于星期四熒光偏振免疫測定原理示意圖（三）熒光偏振免疫測定現(xiàn)在是55頁\一共有102頁\編輯于星期四熒光酶免疫測定熒光物質產生示意圖

酶標記抗體或抗原，與固相載體包被的抗原或抗體特異性結合。洗去游離的酶標物。加入底物，經酶分解后生成熒光產物。（四）熒光酶免疫測定現(xiàn)在是56頁\一共有102頁\編輯于星期四標記酶底物熒光產物λex(nm)λem(nm)響應信號堿性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根過氧化物酶HPA二聚體3174140.03熒光酶免疫測定標記用酶及熒光底物現(xiàn)在是57頁\一共有102頁\編輯于星期四固相抗體和酶標記抗體與待檢抗原反應，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，加入底物進行酶促發(fā)光反應，發(fā)光量與待檢抗原含量成正比。1、雙抗體夾心法現(xiàn)在是58頁\一共有102頁\編輯于星期四熒光酶免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖現(xiàn)在是59頁\一共有102頁\編輯于星期四固相抗原和酶標抗原與待檢抗體反應，形成固相抗原-待檢抗體-酶標抗原復合物，加入底物進行酶促發(fā)光，發(fā)光量與待檢抗體含量成正比。2、雙抗原夾心法現(xiàn)在是60頁\一共有102頁\編輯于星期四待檢抗原和固相抗原競爭結合定量的酶標抗體，洗滌除去未結合部分，固相抗原與酶標抗體形成的復合物被留下來，加入底物進行酶促發(fā)光反應，熒光強度與待檢抗原含量成反比。3、固相抗原競爭法現(xiàn)在是61頁\一共有102頁\編輯于星期四抗核抗體(均質型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)（五）熒光酶免疫技術的應用1、自身抗體檢測現(xiàn)在是62頁\一共有102頁\編輯于星期四寄生蟲（猴胚腎細胞內弓形蟲）細菌（藤黃微球菌)2、病原體檢測現(xiàn)在是63頁\一共有102頁\編輯于星期四腫瘤（人肝癌細胞）3、免疫病理檢測現(xiàn)在是64頁\一共有102頁\編輯于星期四4、細胞表面抗原和受體檢測熒光免疫技術可用于淋巴細胞表面CD抗原、抗原受體、補體受體、Fc受體等的檢測以及淋巴細胞及其亞群的鑒定和計數(shù)?，F(xiàn)在是65頁\一共有102頁\編輯于星期四酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應酶對底物的顯色反應對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析第四節(jié)酶免疫測定一、基本原理現(xiàn)在是66頁\一共有102頁\編輯于星期四（一）常用的酶及其底物1、辣根過氧化物酶（HRP）多用于ELISA方法。四甲基聯(lián)苯胺TMB。反應后顯藍色，加酸終止反應后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性。2、堿性磷酸酶（AP）對-硝基苯磷酸酯（pNPP）。經酶作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。3、β-半乳糖苷酶（β-Gal）多用于均相酶免疫測定。4MUG。經酶作用后生成高強度熒光物，用熒光計測量?，F(xiàn)在是67頁\一共有102頁\編輯于星期四（二）固相載體及其處理1、常用的固相載體塑料制品、微顆粒、膜載體。通過固相載體可以方便的將非均相酶免技術中游離的和結合的抗體（或抗原）酶標記物迅速分離?，F(xiàn)在是68頁\一共有102頁\編輯于星期四2、固相載體的處理⑴包被（coating）：將抗原或抗體結合于固相載體。⑵封閉（blocking）：用1%-5%的牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清消除固相載體表面未結合的位點，消除非特異性吸附?，F(xiàn)在是69頁\一共有102頁\編輯于星期四酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位液體標本中抗原或抗體的定性和定量（三）酶免疫技術分類現(xiàn)在是70頁\一共有102頁\編輯于星期四均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質的檢測。非均相免疫測定中的ELISA應用更為廣泛。常用于傳染病的診斷：病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對”、丙肝抗體、戊肝抗體）、風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒；結核桿菌、幽門螺桿菌。也用于一些蛋白質的檢測：各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原）。（三）酶免疫測定的應用現(xiàn)在是71頁\一共有102頁\編輯于星期四

酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。常用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定。二、均相酶免疫測定現(xiàn)在是72頁\一共有102頁\編輯于星期四1、酶放大免疫測定技術EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

現(xiàn)在是73頁\一共有102頁\編輯于星期四2、克隆酶供體免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

現(xiàn)在是74頁\一共有102頁\編輯于星期四三、酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzyme-linkedimmunosorbentassay（一）基本過程及試劑1、包被：固相的抗原或抗體2、反應：加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體。酶標記物（酶結合物）3、洗滌：使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離4、底物顯色：定性或定量的分析。酶反應的底物現(xiàn)在是75頁\一共有102頁\編輯于星期四1、雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色

應用：二價或二價以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等（二）ELISA檢測抗原的方法現(xiàn)在是76頁\一共有102頁\編輯于星期四現(xiàn)在是77頁\一共有102頁\編輯于星期四雙抗體夾心法測抗原YYYEYEYEYYEYEYEYYYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYYYY現(xiàn)在是78頁\一共有102頁\編輯于星期四2、競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。

應用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）現(xiàn)在是79頁\一共有102頁\編輯于星期四現(xiàn)在是80頁\一共有102頁\編輯于星期四競爭法測抗原YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYEYE現(xiàn)在是81頁\一共有102頁\編輯于星期四1、間接法方法：用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點：一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。應用：常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定。（三）ELISA檢測抗體的方法現(xiàn)在是82頁\一共有102頁\編輯于星期四現(xiàn)在是83頁\一共有102頁\編輯于星期四間接法測抗體YEYYYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEYEY現(xiàn)在是84頁\一共有102頁\編輯于星期四2、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應用：乙型肝炎表面抗體現(xiàn)在是85頁\一共有102頁\編輯于星期四3、競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法應用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測現(xiàn)在是86頁\一共有102頁\編輯于星期四應用于病原體急性感染診斷中的IgM型抗體、甲型肝炎HAV-IgM抗體、乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體的檢測。原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體底物顯色

4、捕獲法現(xiàn)在是87頁\一共有102頁\編輯于星期四現(xiàn)在是88頁\一共有102頁\編輯于星期四捕獲法原理EYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY現(xiàn)在是89頁\一共有102頁\編輯于星期四第五節(jié)固相膜免疫測定一、常用的固相膜及其特點玻璃纖維素(fiberglass)，尼龍(nylon)，聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)，硝酸纖