T細(xì)胞進(jìn)展TCRMHC2012課件

T細(xì)胞識別抗原的分子基礎(chǔ)一、TCR及其共受體二、MHC分子及其與抗原肽的相互作用三、MHC多聚體及其應(yīng)用T細(xì)胞對抗原的識別是

特異性免疫應(yīng)答發(fā)生的先決條件T細(xì)胞識別抗原的物質(zhì)基礎(chǔ)是其表面的TCRTCR識別的配體是與MHC分子結(jié)合的抗原肽TCR識別需要CD4/CD8分子作為共受體AntigenrecognitionbyTcellsrequirespeptideantigensandpresentingcellsthatexpressMHCmolecules一、T細(xì)胞抗原受體（TCR）結(jié)構(gòu)基因及多樣性形成的機(jī)制與抗原肽/MHC復(fù)合物的相互作用ThestructureoftheTcellreceptorStructureofTCRissimilartothatofFab圖1Domainstructure:IggenesuperfamilyMonovalentNoalternativeconstantregionsNeversecretedHeterodimeric,chainsaredisuphide-bondedVeryshortintracytoplasmictailPositivelychargedaminoacidsintheTMregionAntigencombiningsitemadeofjuxtaposedVaandVbregions30,000identicalspecificityTcRpercellTheTcellantigenreceptor? TcRarehighlyvariableinanindividual? DiversityfocusesonsmallchangesintheshapepresentedattheendoftheTcellreceptor(CDR).? ThemechanismsresponsibleforvariabilityarecloselyrelatedtothedevelopmentalstagesofTcells? Themechanismsofdiversitygenerationaresimilartothoseusedintheimmunoglobulingeneswithrespectto: Geneorganisation,rearrangementandrandomjoiningerrorTcellantigenreceptordiversityGenerationofdiversityintheTcRCOMBINATORIALDIVERSITYMultiplegermlinesegmentsInthehumanTcRVariable(V)segments:~70,52Diversity(D)segments:0,2Joining(J)segments:61,13TheneedtopairandchainstoformabindingsitedoublesthepotentialfordiversityJUNCTIONALDIVERSITYAdditionofnon-templateencoded(N)andpalindromic(P)nucleotidesatimprecisejointsmadebetweenV-D-JelementsSOMATICMUTATIONISNOTUSEDTOGENERATEDIVERSITYINTcRTcRagenerearrangementbySOMATICRECOMBINATIONSplicedTcRmRNAGermlineTcRVnJCV2V1RearrangedTcR1°transcriptRearrangementverysimilartotheIgLchainsRearrangedTcR1°transcriptSplicedTcRmRNAL&Vx52D1JC1D2JC2GermlineTcRTcRbgenerearrangementSOMATICRECOMBINATIOND-JJoiningV-DJjoiningC-VDJjoiningGenerationofdiversityintheTcRCOMBINATORIALDIVERSITYRandomrecombinationofmultiplegermlinesegmentsJUNCTIONALDIVERSITYReadingDregionin3framesAdditionofP&NnucleotidesNOSOMATICMUTATIONInTcRTcellreceptor-and-chaingenerearrangementandexpressionElementImmunoglobulin

TcRVariablesegmentsDiversitysegmentsDsegmentsinall3framesJoiningsegmentsJointswithN&PnucleotidesNo.ofVgenepairsJunctionaldiversityTotaldiversityH51~30Rare5235193640~1013~1013~1016**~1016690-5(1)*52~7020Often-136121*OnlyhalfofhumankchainshaveN&Pregions**NoofdistinctreceptorsincreasedfurtherbysomaticmutationEstimateofthenumberofhumanTcRandIgV(D)JrearrangementsduringTcelldevelopment

-chainfirst,then-chainTheoutlinestructuresoftheCD4andCD8co-receptormoleculesCoreceptorinteractionsCD4:monomer,4IgSFdomains,bindingMHCII.CD8:2chainswithsingleIgSFdomain,

CD8:conventionalMHCI

CD8:nonclassicalMHCITheCD8-MHCinteractionhasaKoffatleast2ordersofmagnitudefasterthanTCR-pMHCinteractions,andtheCD4-MHCinteractionseemstobemuchlessstable.CoreceptorsbindtothesameMHCmoleculeengagedbytheTCR,andassociatewiththeTCRviathesignalingmoleculesp56lckandZAP-70.ThebindingsitesforCD4andCD8onMHClieintheIg-likedomainsCoreceptorinteractionsandstructurehierarchicalaffinitydifferencesinTCR-pMHCandcoreceptor-MHCcomplexesensuretheseeventsoccursequentially.TheTcellreceptorbindstotheMHC:peptidecomplex（一）經(jīng)典的HLA-I類和-II類抗原1．HLA-I類分子結(jié)構(gòu) *由鏈（重鏈）和鏈（輕鏈）組成的異源二聚體，其中重鏈由HLA-I類基因編碼且為跨膜鏈，具有多態(tài)性。 *可分為4個區(qū)

(1)肽結(jié)合區(qū)：結(jié)合抗原肽，多態(tài)性區(qū)域

(2)Ig樣區(qū)：與CD8分子結(jié)合的部位

(3)跨膜區(qū)：將HLA分子錨定在胞膜上

(4)胞漿區(qū)：與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)ThestructureofanMHCclassImolecules(determinedbyX-raycrystallography)MHC-I類分子結(jié)構(gòu)α鏈：43KDaβ鏈：12KDa2.HLA-II類分子的結(jié)構(gòu) *由鏈和鏈組成的異源二聚體，鏈和鏈均由HLA-II類基因編碼且均為跨膜鏈，均具有多態(tài)性。 *可分為4個區(qū)

(1)肽結(jié)合區(qū)：結(jié)合抗原肽，多態(tài)性區(qū)域

(2)Ig樣區(qū)：與CD4分子結(jié)合的部位

(3)跨膜區(qū)：將HLA分子錨定在胞膜上

(4)胞漿區(qū)：與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)ThestructureofanMHCclassIImolecules(resembleMHCclassImoleculesinstructure)MHC-II類分子結(jié)構(gòu)α鏈：34KDaβ鏈：29KDa（二）MHC生物學(xué)功能及其分子機(jī)制1、MHC分子的生物學(xué)功能抗原提呈MHC分子的抗原結(jié)合凹槽選擇性結(jié)合抗原肽→形成MHC分子-抗原肽復(fù)合物→以MHC限制性的方式供T細(xì)胞識別→啟動特異性免疫應(yīng)答。*CD4+T細(xì)胞識別抗原肽/MHC-II復(fù)合物*CD8+T細(xì)胞識別抗原肽/MHC-I復(fù)合物MHC分子提呈抗原肽供T細(xì)胞識別TCR識別抗原肽的MHC限制性2、MHC分子與抗原肽的相互作用（1）抗原肽和MHC分子相互作用的分子基礎(chǔ)MHC分子方面*MHC的多態(tài)性集中在結(jié)合區(qū)

MHC分子與抗原肽結(jié)合的部位是肽結(jié)合區(qū)中的肽結(jié)合槽，是多態(tài)性集中的區(qū)域，即型別不同的MHC分子的抗原肽結(jié)合槽部位的氨基酸組成和順序存在差異。等位基因多態(tài)性集中于肽結(jié)合區(qū)抗原肽方面*抗原肽借助錨定殘基與MHC分子的抗原肽結(jié)合槽結(jié)合錨定殘基：抗原肽并不是整段地與抗原肽結(jié)合槽結(jié)合，而是以2個或數(shù)個氨基酸殘基結(jié)合于MHC分子的抗原肽結(jié)合槽中，抗原肽上這些氨基酸殘基為錨定殘基?？乖囊藻^著殘基與MHC抗原肽結(jié)合槽結(jié)合PeptidebindstoMHC-Imoleculethroughanchorresidues

PeptidesbindingtoMHC-IImoleculesarevariableinlengthandresidueslieatvariousdistancesfromtheendsofthepeptide

（2）抗原肽與MHC分子相互作用 *抗原肽借助錨定殘基與MHC分子抗原結(jié)合槽結(jié)合 *不同MHC等位基因產(chǎn)物，其抗原結(jié)合槽結(jié)構(gòu)存在差異，從而決定其選擇性結(jié)合不同的抗原肽 *能夠與同一型別MHC分子結(jié)合的抗原肽，其錨定位和錨定殘基往往相同或相似3、MHC型別影響個體對抗原應(yīng)答性質(zhì)和強(qiáng)度

*不同MHC提呈同一抗原分子的不同抗原肽

應(yīng)答針對的表位不同*同一抗原肽與不同MHC結(jié)合的親合力不同

應(yīng)答的強(qiáng)度不同MHCallelescontroltheimmuneresponsivenessMHC分子提呈抗原肽供T細(xì)胞識別（一）MHC-抗原肽四聚體

MHC-抗原肽四聚體是借助親和素-生物素結(jié)合的原理，在體外將MHC分子（MHC-I類分子包括β2微球蛋白）及其所提呈的抗原肽組裝成的MHC/抗原肽四聚復(fù)合物，作為TCR結(jié)合的配體，用于檢測和分離特異性T細(xì)胞三、MHC-抗原肽四聚體技術(shù)（MHC-peptidetetramer）HLA-抗原肽四聚體結(jié)構(gòu)示意圖

通過生物素-親和素的作用，將4個MHC-I/抗原肽單體連接成四聚體，親和素分子上還結(jié)合有熒光標(biāo)記物質(zhì)（PE），用于檢測或分離抗原特異性T細(xì)胞HLA-抗原肽四聚體用于檢測或分離特異性T細(xì)胞（二）HLA-I/抗原肽四聚體的應(yīng)用1、檢測病毒抗原特異性CTL*CMV抗原肽/HLA-I四聚體

CMV特異性T細(xì)胞頻率的檢測可以作為肝臟移植后CMV感染或激活的早期診斷指標(biāo)之一*EBV抗原肽/HLA-I四聚體 移植患者在術(shù)后4周，EB病毒抗體為陰性的患者中，可檢測到EB病毒特異性的T細(xì)胞擴(kuò)增，可以作為術(shù)后EBV感染的檢測和診斷指標(biāo)。*HCV抗原肽/HLAI四聚體 丙型病毒肝炎患者中，與康復(fù)的患者比較，慢性肝炎患者白細(xì)胞中的特異性CTL數(shù)量升高，但功能受損，表現(xiàn)為后者的特異性CTL的增殖能力下降，特異性殺傷能力下降和產(chǎn)生IFN-γ能力下降，而且IL-2不能恢復(fù)受損的特異性CTL功能。但是這些患者的流感病毒特異性CTL的功能是正常的。2、研究自身免疫病發(fā)生機(jī)制*GAD65/HLA-DR4四聚體

65kDaglutamicaciddecarboxylase(GAD65)被認(rèn)為是IDDM的自身抗原，其中含有DR4結(jié)合的免疫顯性表位（555-567），外周血標(biāo)本中GAD65/HLA-DR4特異性T細(xì)胞識別相應(yīng)的抗原提呈細(xì)胞提呈抗原肽后，用GAD65/HLA-DR4四聚體和流式細(xì)胞儀檢測，所有IDDM患者和部分高危個體的標(biāo)本能夠檢測到活化的GAD65/HLA-DR4特異性T細(xì)胞（CD4+/CD25+），而正常對照組卻未能觀察到。3、評價腫瘤疫苗的效果例如HLA-I/Melan-A用于免疫治療方法的評估。4、制備抗原特異性T細(xì)胞*流式細(xì)胞分選-體外培養(yǎng)法制備抗原特異性的T淋巴細(xì)胞：被特定HLA/抗原肽四聚體結(jié)合的T細(xì)胞克隆通過熒光激活的細(xì)胞分選方法分離出來，在體外用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行刺激并擴(kuò)增。*MHC四聚體修飾APC-體外培養(yǎng)法制備抗原特異性的T淋巴細(xì)胞：用親和素-抗B細(xì)胞抗體融合蛋白（anti-CD20B9E9-scFvSA）將HLA-I/抗原肽復(fù)合物（HLA-I類分子經(jīng)過生物素化）結(jié)合到自身B細(xì)胞表面，將經(jīng)過處理的B細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，與PBMN在體外培養(yǎng)8-14天，僅需一次刺激便可產(chǎn)生特異性CTL。這種方法為體外擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞提供了有效手段，例如制備病毒抗原、腫瘤抗原特異性的CTL。5、與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用研究抗原特異性T細(xì)胞*四聚體技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用能夠檢測抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞周期（活化與增殖）、死亡方式（衰老和凋亡）、效應(yīng)功能（胞毒能力和細(xì)胞因子產(chǎn)生）。有利于研究在各種環(huán)境和疾病狀態(tài)下抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生、活化和功能，從而揭示細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制。T細(xì)胞識別配體的多聚化提高了與受體結(jié)合的親和力pMHC四聚體：應(yīng)用于特異性同種T細(xì)胞的檢測pMHC二聚體：誘導(dǎo)或抑制特異性同種T細(xì)胞圖1.pMHC四聚體結(jié)構(gòu)示意圖圖2.pMHC二聚體結(jié)構(gòu)示意圖可溶性pMHC二聚體特異性抑制同種T細(xì)胞應(yīng)答

圖7.可溶性pMHC二聚體誘導(dǎo)特異性的同種T細(xì)胞耐受的示意圖Tyr/HLA-A2二聚體抑制增殖作用具有pMHC特異性圖9.增殖抑制反應(yīng)a,HLA-A2-vePBLsb,HLA-A2-vePBLs與T2/Tyr混合培養(yǎng)c,b+抗原肽Tyr368-376

d,b+HIV/HLA-A2二聚體

e,b+Tyr/HLA-A2二聚體

Tyr/HLA-A2二聚體抑制同種反應(yīng)體系中

CD8＋T細(xì)胞的增殖圖8.在T2/Tyr與HLA-A2-vePBLs混合培養(yǎng)體系中，Tyr/HLA-A2二聚體對T細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性，并可被HLA-A2特異性抗體BB7.2阻斷。XiufangWeng,MaohuaZhong,ZhihuiLiang,ShengjunLu,XuelingChen,JananLi,JuanHao,FeiliGong,XiongwenWu*.

Peptide-dependentinhibitionofalloreactiveT-cellresponsebysolub