液態(tài)活檢技術(shù)與其臨床應(yīng)用

傳統(tǒng)的腫瘤診斷技術(shù)傳統(tǒng)腫瘤診斷技術(shù)病理檢驗診斷影像學(xué)檢測病理組織檢查（HE，IHC）血清標(biāo)志物檢測（CEA,PSA)核磁共振成像（MRI）正電子成像術(shù)（PET-CT）X射線斷層掃描術(shù)（XRAY,CT）超聲波檢測（B超）內(nèi)窺鏡（Endoscope）分子病理檢測（FISH,RT-PCR,NGS）第一頁，共25頁。傳統(tǒng)的腫瘤診斷存在的問題早期篩查：標(biāo)記物不統(tǒng)一,方法不夠靈敏或是特異性不足。臨床診斷:影像學(xué)：較靈敏，特異性不足，對病灶大小有要求。病理學(xué)：金標(biāo)準(zhǔn)，但是需要組織樣本，取樣會帶來創(chuàng)傷和擴散風(fēng)險，很多晚期患者無法取樣或取樣不足。治療/復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測：影像學(xué)：結(jié)果普遍存在滯后性。血清標(biāo)志物：較靈敏，但是特異性不足；有些類型癌癥沒有合適的血清標(biāo)志物。第二頁，共25頁。2015年十大突破技術(shù)--液態(tài)活檢技術(shù)MITTechnologyReview雜志發(fā)布了2015年度十大突破技術(shù)(10BreakthroughTechnologies2015)的榜單。液態(tài)活檢技術(shù)光榮上榜。液態(tài)活檢：快速、簡便、無痛苦、無創(chuàng)傷的癌癥血液檢測方法第三頁，共25頁。傳統(tǒng)而又嶄新的檢測技術(shù)

--“液態(tài)活檢”“液態(tài)活檢”的定義：Aliquidbiopsyisaliquidbiomarkerthatcanbeeasilyisolatedfrommanybodyfluidsblood,saliva,urine,ascites,pleuraleffusion,etc.)and,aswellasatissuebiopsy,arepresentativeofthetissuefromwhichitisspread.液體活檢是一種液體生物標(biāo)志物，可以容易地從許多體液中分離血液，唾液，尿液，腹水，胸腔積液等），以及組織活組織檢查法，其是從其傳播的組織的代表。

--ChristianRolfo,BiochimicaetBiophysicaActa,2013.第四頁，共25頁?！耙簯B(tài)活檢”的標(biāo)記物CTCsctDNA(cfDNA)主要指來自于抗凝的外周血全血，完整的腫瘤細(xì)胞主要指來自于抗凝血外周血的血漿，片段化的DNA片段一般認(rèn)為來源于腫瘤原發(fā)灶/轉(zhuǎn)移灶腫瘤瘤細(xì)胞凋亡/壞死釋放的DNA片段活細(xì)胞，一般不宜長期保存提取純化后的核酸，可以保存可以用于細(xì)胞學(xué)形態(tài)、結(jié)構(gòu)分析；也可以分析細(xì)胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)等各類標(biāo)志物一般用于DNA突變監(jiān)測、甲基化等DNA修飾相關(guān)分析用于病情評價、預(yù)后判斷，腫瘤早期診斷潛力不明確用于個體化治療，腫瘤早期診斷潛力相對明確還有miRNAs，Peptides，Exosomes（外泌體），Secretomes（分泌物質(zhì)組）等。第五頁，共25頁。ctDNA（circulatingtumorDNA），即循環(huán)腫瘤DNA，從字面意思來講，指的是由腫瘤細(xì)胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的DNA。但是在了解ctDNA之前，我們要知道另一個與之相關(guān)的概念——cfDNA。

cfDNA（cell-freeDNA），或者叫血漿游離DNA，是血漿中游離存在的DNA，它們有的來自于正常細(xì)胞，有的來自于異常細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），還有部分來自于我們外部（如病毒DNA）。

來源：1、來自于壞死的腫瘤細(xì)胞2、來自于凋亡的腫瘤細(xì)胞3、來自于腫瘤細(xì)胞分泌的外排物什么是ctDNA?第六頁，共25頁。早在1947年，Mandel和Metais就發(fā)現(xiàn)血漿中存在游離的核酸分子。1977年，Leon等人發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者的血漿游離DNA水平要明顯高于健康人群又過了17年，人們才發(fā)現(xiàn)這種攜帶了突變信息的循環(huán)DNA是腫瘤的標(biāo)志人們逐漸明白，cfDNA中攜帶腫瘤特有突變的那一小部分DNA，確確實實是由腫瘤細(xì)胞釋放出來的，ctDNA的研究終于與腫瘤關(guān)聯(lián)起來。ctDNA的發(fā)現(xiàn)第七頁，共25頁。在幾乎所有種類的癌癥中，都檢測到了ctDNA所帶有的標(biāo)志性突變，并且腫瘤越晚期，病情越嚴(yán)重，腫瘤的惡性程度越高，ctDNA特有突變的頻率就越高。一項針對15種癌癥進行的ctDNA測序研究顯示，分別有47%，55%，69%，82%的I-IV期癌癥病人中能檢測到高于一定頻率的ctDNA突變；而另一項使用更高靈敏度測序技術(shù)的研究則表示，對于II期以上的病人，均能100%檢測到突變。不同分期癌癥的ctDNA檢出情況不同癌癥種類的ctDNA檢出情況第八頁，共25頁。CtDNA臨床應(yīng)用領(lǐng)域

CtDNA作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，將在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后檢測等方面發(fā)揮重要的作用，尤其是對于一些不具有典型臨床癥狀、檢查無特異性和診斷困難的腫瘤可避免復(fù)雜的、具有創(chuàng)傷性的活檢。ctDNA來自腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變，不同于遺傳突變的是，遺傳突變存在于體內(nèi)每個細(xì)胞。因此，ctDNA是一種特征性的腫瘤生物標(biāo)記物，并且還可以被定性、定量和追蹤。第九頁，共25頁。檢測9名接受特羅凱一線治療的NSCLC患者血漿中ctDNA的EGFR突變情況，一直到患者進展至PD。在接受治療后，所有患者血漿中的含有EGFR突變的ctDNA濃度出現(xiàn)下降，其中8人的EGFR突變完全消失。有6名患者的血漿中重新檢測到EGFR突變的時間要比進展至PD的時間早4個月以上！隨著治療，所有9名患者的血漿中均檢出一定量T790M突變。血漿中沒有檢測到EGFR的3名患者，進展至PD期時，其腫瘤僅在胸腔內(nèi)有緩慢進展。利用NSCLC癌患者血漿中的ctDNA檢測EGFR突變現(xiàn)有技術(shù)用石蠟組織切片樣本只能檢測60copies以上的突變含量，但是用液態(tài)活檢通過數(shù)字PCR平臺卻可以檢測0-60copies之間的突變含量，更早的發(fā)現(xiàn)病情及耐藥性，對于癌癥患者如果能提前4個月發(fā)現(xiàn)病情的變化，生存率會大大提高。--ClinCancerRes,2014,march第十頁，共25頁。著名的JohnsHopkins大學(xué)最近的一項研究揭示了ctDNA的真面目，它其實是一種具備廣泛應(yīng)用前景、高敏感性、高特異性的腫瘤標(biāo)志物，--NatureMedicine,2014,May第十一頁，共25頁。研究者還在不同級別的肺癌患者中對CAPP-Seq進行了驗證，發(fā)現(xiàn)II-IV期的NSCLC中檢測敏感性100%，I期的NSCLC中敏感性為50%，而且在各期的肺癌中的特異性均在96%。在II-IV期和所有分期的肺癌中，根據(jù)ROC曲線計算出的AUC分別為0.99和0.95，所以CAPP-Seq具有強大的檢測能力。臨床資料表明，ctDNA比例低至0.019%的時候也還能夠被CAPP-Seq檢測到。第十二頁，共25頁。研究者用CAPP-Seq測定的ctDNA的水平和腫瘤體積（腫瘤體積用CT和PET評估測定）之間存在顯著相關(guān)性（p=0.0002，R2=0.89），除了幾例I期肺癌患者的腫瘤體積明顯高于其ctDNA相對應(yīng)的大小。隨訪研究發(fā)現(xiàn)ctDNA水平隨著疾病進展和相應(yīng)的治療，也在不斷變化。對10例樣本（7例陽性和3例陰性）進行了腫瘤標(biāo)本（侵入性的活檢）和血液標(biāo)本（非侵入性的CAPP-Seq檢測）在篩查和基因型（EGFR和KRAS）檢測中的對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAPP-Seq并不比金標(biāo)準(zhǔn)腫瘤活檢的檢測效能差，能夠準(zhǔn)確測定肺癌的基因型。第十三頁，共25頁。ctDNA中PI3KCA的檢測可用于預(yù)測原發(fā)性乳腺癌患者的預(yù)后1.ctDNA有PI3KCA檢出的乳腺癌患者，其預(yù)后要比沒有檢出的患者差。--BreastCancerResTreat，2015，March2.ctDNA中PI3KCA拷貝數(shù)高的乳腺癌患者，其預(yù)后要比拷貝數(shù)低的患者差。第十四頁，共25頁。循環(huán)腫瘤細(xì)胞指從實體瘤中脫離出來并進入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。CTC形成、播散及轉(zhuǎn)移的模式圖原發(fā)腫瘤血管生成侵潤侵入血管內(nèi)侵入血管外

(CTC)血管內(nèi)增殖

(CTM)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移播散腫瘤細(xì)胞（DTC）微轉(zhuǎn)移休眠灶循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）循環(huán)腫瘤

微栓（CTM）凋亡的CTC侵潤腫瘤細(xì)胞

擴增血管生成上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）間質(zhì)－上皮轉(zhuǎn)化（MET）轉(zhuǎn)移到骨髓和其他器官第十五頁，共25頁。16CTC的稀有性和異質(zhì)性Cancers,2013；Nature

ReviewofClinicalOncology,2010第十六頁，共25頁。CTC的臨床應(yīng)用方向CTC檢測6、指導(dǎo)用藥3、術(shù)后監(jiān)控1、預(yù)后評估2、療效監(jiān)測5、早期篩查4、輔助診斷第十七頁，共25頁。用兩種不同的方法檢測CTC以評估

非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后1.ISET法檢出率為104/210(50%)，CellSearch法檢出率為82/210(39%)，兩種方法檢出CTC的患者的DFS均明顯劣于無CTC檢出的患者。2.ISET法檢出23/210（11%）的患者外周血中含有間質(zhì)化的CTC細(xì)胞，這種細(xì)胞通常意味著更強的侵襲性。ISET法和CellSearch法可以作為CTC檢測的互補的方法，兩種方法單獨或者聯(lián)合使用都可以用于檢測CTC，以評估肺癌手術(shù)的預(yù)后。

--Int.J.Cancer，2011，Vol129第十八頁，共25頁。放療前，65%患者檢出CTC，平均檢出率9.1CTCs/ml，明顯高于放療后的CTC平均數(shù)（0.6個）。有1名在放療后CTC明顯未降低的患者，出現(xiàn)遠端轉(zhuǎn)移。--CancerJ，2015，121(1)通過檢測非小細(xì)胞肺癌患者的外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞評價放療療效第十九頁，共25頁。CTC可作為慢性阻塞性肺炎（COPD）患者

肺癌早期診斷的新的標(biāo)志物20HofmanP.，PLoSOne，2014，Vol9（10）分類COPD患者吸煙者健康人檢測結(jié)果CTC+CTC-CTC-CTC-人數(shù)51634235當(dāng)時是否檢測出癌癥NoNoNoNo5年內(nèi)檢測出癌癥Yes

(5/5)NoNoNo第二十頁，共25頁。CTCv.s.ctDNA

—互相排斥還是互為補充？1.可能來源于非腫瘤組織，特異性低；2.血漿中含量較豐富，檢測方法簡便；3.來自多個細(xì)胞的更全面的遺傳信息，但一般來自于凋亡的腫瘤細(xì)胞；4.ctDNA用于實時監(jiān)測乳腺癌等疾病的進展和療效時，靈敏度更高；

5.因為不含特異性突變，ctDNA不適用于某些癌癥的檢測，比如腎癌。V.S.1.細(xì)胞形態(tài)結(jié)合分子標(biāo)記，特異性高；2.血液中數(shù)量稀少，檢測難度大；3.只能代表腫瘤細(xì)胞的部分亞群，但是是最有侵襲性的一部分細(xì)胞；4.反向選擇的CTCs檢測適用于大多數(shù)癌癥種類，但有些癌癥檢出率太低。5.完整的有活性的腫瘤細(xì)胞個體，能檢測對藥物的反應(yīng)；可以提供新的腫瘤治療靶點，可以幫助理解腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。CTCsCtDNACTCs與ctDNA檢測的有機結(jié)合才是未來的方向！第二十一頁，共25頁。ctDNA及CTC檢測與NSCLC的靶向治療療效的相關(guān)性檢測EGFR突變時，ctDNA比CTCs更為靈敏，而且與原位腫瘤的一致性更高。--ClinCancerRes

，2012，April2.CTC數(shù)量的減少更適宜用于作為快速評價療效反應(yīng)的標(biāo)記物。第二十二頁，共25頁。文章主要通過數(shù)字PCR比較CtDNA、腫瘤標(biāo)記物及循環(huán)腫瘤細(xì)胞三個方法的比較，其中CtDNA靈敏度為97%，循環(huán)腫瘤細(xì)胞87%，腫瘤標(biāo)記物靈敏度為78%，。--NEJM，2013，March第二十三頁，共