藥物分析05體內(nèi)藥物分析

CompanyLogo第五章體內(nèi)藥物分析體內(nèi)藥物分析定義體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。第一頁，共77頁。CompanyLogo第五章體內(nèi)藥物分析分析意義與體內(nèi)藥代動力學(xué)研究和臨床治療藥物監(jiān)測密切相關(guān)，直接關(guān)系到藥物的體內(nèi)作用機制探討與質(zhì)量評價和藥物臨床使用的安全、有效與合理。對乙酰氨基酚N-乙酰對苯醌亞胺肝毒性第二頁，共77頁。CompanyLogo第五章體內(nèi)藥物分析分析樣品種類血液尿液唾液頭發(fā)臟器組織其它特殊樣品?第三頁，共77頁。CompanyLogo第五章體內(nèi)藥物分析分析目標(biāo)藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們在體內(nèi)的變化規(guī)律對母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評價特別重要.機體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機體重要的生理過程,其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)母藥藥物特有代謝產(chǎn)物體內(nèi)內(nèi)源性生物活性物質(zhì)第四頁，共77頁。CompanyLogo第五章體內(nèi)藥物分析分析對象人動物鼠兔犬大鼠小鼠雄雌Justajoke等等猴猩猩都是一些志愿者也有一些不知情的人須動物管理與使用委員會同意第五頁，共77頁。CompanyLogo分析對象第六頁，共77頁。CompanyLogo第五章體內(nèi)藥物分析藥物在體內(nèi)的形態(tài)游離型代謝產(chǎn)物游離型原藥結(jié)合型原藥結(jié)合型代謝產(chǎn)物情形極為復(fù)雜綴合物分子間力結(jié)合化學(xué)共價結(jié)合稱為兩類第七頁，共77頁。CompanyLogo四、體內(nèi)藥物分析的特點體內(nèi)樣品性質(zhì)及分析特點采樣量少藥物濃度低干擾物質(zhì)多數(shù)毫升,至數(shù)十微升,一般在特定條件下采集,且不易重新獲取生物活性物質(zhì)的濃度在納克級到微克級水平,甚至皮克級水平蛋白質(zhì),脂肪,尿素,鉀,鈉,代謝產(chǎn)物,內(nèi)源性物質(zhì)………….樣品需要分離富集,或者衍生化處理才能分析樣品分析方法需要高靈敏度與專屬性分析工作量,數(shù)據(jù)處理和結(jié)果闡明較為復(fù)雜第八頁，共77頁。CompanyLogo五、體內(nèi)藥物分析方法體內(nèi)樣品分析方法色譜及其聯(lián)用方法免疫學(xué)方法生物學(xué)微生物學(xué)方法HPLC,GC,HPLC-MS,HPLC-MS/MS,GC-MS,GC-MS/MS放射（RIA）熒光（FIA）酶（EIA）適合小分子及代謝物，蛋白質(zhì)大分子藥物等生物大分子藥物分析抗生素分析第九頁，共77頁。CompanyLogo第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏常用樣品的種類(一)血樣:藥物在體內(nèi)主要依靠血液運輸,血藥濃度可作為藥物在作用部位濃度的指標(biāo).

①血漿(plasma)②血清(serum)③全血(二)唾液:很少采用(三)尿液:用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度，藥物代謝物及其代謝途徑、類型、速率等的研究；臨床上用于判斷患者是否違反醫(yī)囑用藥。第十頁，共77頁。CompanyLogo其它：頭發(fā)、肝器組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便。常用樣品的種類第十一頁，共77頁。CompanyLogo采集和制備1、血樣：一般從肘靜脈采血，也可從毛細管采血。每次采血1-5ml，動物采血時一般不超過動物總血量的十分之一。2、血漿：靜脈離心5-10分鐘，使與血細胞分離；3、血清：靜脈血放置30-60分鐘。1000g離心5-10分鐘。4、全血：加抗凝劑，不離心，血漿和血細胞分布均勻。采集方法第十二頁，共77頁。CompanyLogo2．尿樣目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度特點：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分離采集方法：隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿等，定時采集。貯藏:健康人排出的尿液顏色淡黃至黃褐色,pH在4.8~8.0之間。3．唾液唾液中藥濃與血濃相關(guān)性密切收集方法瀨口15min鐘后采集，離心收集采集方法第十三頁，共77頁。CompanyLogo組織采集：先取各種組織，應(yīng)用勻漿器均勻化制成水性基質(zhì)勻漿液，再以適當(dāng)方法萃取。組織樣品要經(jīng)過蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。酸、堿水解：將組織水解掉酶水解：應(yīng)用酶將組織水解掉其它：頭發(fā)等組織樣品藥物在組織中的分布提供重要的體內(nèi)動力學(xué)過程第十四頁，共77頁。CompanyLogo體內(nèi)樣品貯存與處理冷藏與冷凍去活性-20℃到-80℃,低溫終止酶的活性其它方式去除酶的活性，防止樣品進一步代謝分解樣本量大，分析時間長，要保證藥物不變質(zhì)，須貯存與處理第十五頁，共77頁。CompanyLogo1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-70℃加入穩(wěn)定劑NaF2．尿樣①尿中水、無機鹽、尿素等細菌的生長，4℃保存②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣冷凍與冷藏第十六頁，共77頁。CompanyLogo去活性去活性：為防止酶進一步分解體內(nèi)待測組分，采樣后必須終止酶的活性。常用方法有“液氮快速冷凍法、微波照射法、勻漿及溶淀，加酶活性阻斷劑、抗氧化劑、樣品煮沸等。第十七頁，共77頁。CompanyLogo第二節(jié)、體內(nèi)樣品的前處理體內(nèi)樣品的前處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié),也是分析中最困難、最繁復(fù)的工作。請先看如下處理步驟與方法第十八頁，共77頁。CompanyLogo第二節(jié)體內(nèi)樣品分析的前處理全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀(2)調(diào)節(jié)pH選擇性溶劑提取RIA殘渣化學(xué)衍生化(提取烴基化)堿回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS處理步驟與方法第十九頁，共77頁。CompanyLogo預(yù)處理的目的使待測藥物游離滿足測定方法要求改善分析環(huán)境藥物進入體內(nèi)后有多種存在形式，進行預(yù)處理使之游離出來，便于測定藥物或代謝藥物的總濃度體內(nèi)樣品介質(zhì)組成復(fù)雜，干擾很多，而待測藥物組分濃度很低，進行預(yù)處理可以分離濃集樣品。防止儀器的污染、劣化，提高測定的靈敏度和選擇性。不同的儀器及分析方法對樣品有不同的要求，須處理。第二十頁，共77頁。CompanyLogo常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法去除蛋白質(zhì)方法分離與富集方法微透析技術(shù)綴合物水解化學(xué)衍生化萃取如何進行？第二十一頁，共77頁。CompanyLogo蛋白質(zhì)的去除加入與水混融的有機溶劑(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)加入強酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金屬沉淀劑(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)綴合物的水解酸水解(鹽酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有機破壞(硝酸-高氯酸消化)分離、純化與濃集液-液萃取法

(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法

(Liquid-SolidExtraction,LSE)P181P185溶解劑法(硝酸-高氯酸消化)常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法第二十二頁，共77頁。CompanyLogo去除蛋白質(zhì)方法加入與水混融（親水性）的有機溶劑（乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃）。溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間靜電力增加而聚集；親水性溶劑使蛋白質(zhì)水化膜脫落而析出沉降，并使與蛋白質(zhì)以氫鍵及其它分子間作用力結(jié)合的藥物析釋放出來。

溶劑沉淀法混比1：2~3，

冷凍離心第二十三頁，共77頁。CompanyLogo去除蛋白質(zhì)方法混比1：2，

冷凍離心加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)，使溶液的離子強度發(fā)生變化，部分蛋白質(zhì)的電性被中和，蛋白質(zhì)的分子間排斥力減弱而凝聚；同時中性鹽使蛋白質(zhì)水化膜脫落而析出沉降。中性鹽析法第二十四頁，共77頁。CompanyLogo去除蛋白質(zhì)方法混比1：0.6，

冷凍離心加入強酸(10%三氯醋酸、6%高氯酸等)，影響蛋白質(zhì)等電點及開成不溶性鹽而沉降。強酸沉降法第二十五頁，共77頁。CompanyLogo去除蛋白質(zhì)方法熱變性蛋白質(zhì)

離心煮雞蛋？熱凝固法第二十六頁，共77頁。CompanyLogo（1）優(yōu)點：①與雜質(zhì)分離②簡便③濃集④提取率高（2）提取率：在有機相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對生物樣品一般一次萃取，>70%重現(xiàn)性分離與

濃集液液萃取

LLE利用藥物在有機溶劑中的溶解度大于在水中的溶解度而提取第二十七頁，共77頁。CompanyLogo（3）影響提取率的因素①pH堿性藥物在堿性pH酸性酸性pH②提取溶劑相似相溶原理沸點低，不影響檢測,性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng)(化學(xué)惰性）③離子強度加入中性鹽增加離子強度，與水結(jié)合強，便于有機溶劑提取分離與

濃集第二十八頁，共77頁。CompanyLogo對于離子性特強，水溶性極大的藥物，可采用離子對提?、僭恝趹?yīng)用陰離子：COOH+SO3H-

反離子四丁基銨陽離子：NH2+

反離子烷基或芳基磺酸鹽提取溶劑用量:一般在試管中進行有機相與水相比1:1到5:1分離與

濃集第二十九頁，共77頁。CompanyLogo分離與

濃集固相萃取

SPE是目前使用相當(dāng)廣泛的一種萃取方法，惜乎價格較貴將不同填料作為固定相裝入小柱，藥物溶液通過小柱時，藥物被吸附、分配、離子交換，或其它親和力作用，使藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時被保留在固定相上，再選用適當(dāng)溶劑洗脫藥物的方法這方面，美國是老大第三十頁，共77頁。CompanyLogo用有機溶劑(甲醇)沖洗——洗凈用水沖洗——活化上樣用水或緩沖液沖洗，洗去內(nèi)源性物質(zhì)有機溶劑洗脫藥物收集洗脫液······固相萃取步驟第三十一頁，共77頁。CompanyLogo方法好

價格貴第三十二頁，共77頁。CompanyLogo①固相選擇樣品1ml1ml規(guī)格固相1~25ml3ml規(guī)格固相②固相處理反相C18

固定相的6~10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化

6~10倍水緩沖服液沖洗達分離狀態(tài)③上樣④分離用適當(dāng)?shù)娜跞軇┫礈煜慈ルs質(zhì)，通N2干燥固相⑤洗脫待測物改變pH或極性固相萃取具體步驟第三十三頁，共77頁。CompanyLogo（1）流速流速快，按觸不充分，樣品流失回收率低柱處理5~10ml·min-1

洗脫0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml·min-1（>300mg）（2）裝樣過載突破性試驗已知濃度樣品液①小體積上柱→洗脫回收百分率②加大體積→洗脫回收百分率③繪圖當(dāng)回收率下降時為過載固相萃取具體步驟第三十四頁，共77頁。CompanyLogo超濾

分離法是以多孔半透膜（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)，選用不同的孔徑的不對稱膜，即可按照分子量大小進行分離適合TDM血樣分析Therapeuticdrugmonitoring第三十五頁，共77頁。CompanyLogo綴合物的水解酶水解法酸水解法溶劑解法book第三十六頁，共77頁。CompanyLogo化學(xué)

衍生法why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進行衍生HowforGC?硅烷化?；榛粚ΨQ化第三十七頁，共77頁。CompanyLogo化學(xué)

衍生法why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測的需要，因此進行衍生HowforLC?UVFL非對映衍生化?第三十八頁，共77頁。CompanyLogo化學(xué)

衍生法非對映衍生化?對映體：一個化合物的兩個光學(xué)異構(gòu)體，其分子在整體上互為不能重疊的鏡像。分子量、分子式完全相同。應(yīng)用普通色譜方法難以分離。通過衍生可以使之非對映化。根據(jù)構(gòu)象等理化性質(zhì)差異進行分離。第三十九頁，共77頁。CompanyLogo分析方法的建立方法

的選擇Chromatography？immunoassay？biology？第四節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證第四十頁，共77頁。CompanyLogo分析方法的建立方法建立

的程序條件篩選？條件優(yōu)化？實際樣品測試？第四十一頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化試劑與溶劑實驗經(jīng)化學(xué)衍生化處理時要進行此步試驗取待測藥物的非生物介質(zhì)溶液（通常為水溶液），按擬定的分析方法進行衍生化反應(yīng)，萃取，分離等樣品預(yù)處理后，進樣分析以考察反應(yīng)試劑對測定的干擾，通過條件優(yōu)化，使空白試劑色譜峰不干擾藥物的測定第四十二頁，共77頁。CompanyLogo相關(guān)術(shù)語生物介質(zhì)來源于生物的介質(zhì)，如全血，血漿，血清，尿，糞，各種組織等取空白生物介質(zhì)按照擬定的體內(nèi)樣品預(yù)處理與分析方法進行操作。生物介質(zhì)實驗色譜條件優(yōu)化第四十三頁，共77頁。CompanyLogo相關(guān)術(shù)語取空白生物介質(zhì)按照擬定的體內(nèi)樣品預(yù)處理與分析方法進行操作。生物介質(zhì)實驗?zāi)康模河糜诳疾焐锝橘|(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)對測定的的干擾情況。要求：在待測藥物，特定的活性代謝產(chǎn)物，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等的信號窗口不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號色譜條件優(yōu)化第四十四頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化質(zhì)控樣品試驗取空白生物介質(zhì)，按實際體內(nèi)樣品中藥物的預(yù)期濃度范圍，加入待測藥物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品，照生物介質(zhì)試驗項下的方法進行實驗，建立分析方法的定量范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行方法學(xué)考察標(biāo)準(zhǔn)物品？質(zhì)控樣品？第四十五頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化即QC樣品，系指在空白生物介質(zhì)中加入已知量待測藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成的樣品質(zhì)控樣品？主要用于監(jiān)測生物分析方法的效能和評價每一分析批結(jié)果的完整性和正確性第四十六頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)物品？在空白生物介質(zhì)中加入已知量的待測物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成的樣品主要用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算質(zhì)控樣品和未知樣品的濃度第四十七頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)物品？質(zhì)控樣品？相同點制備方法完全一樣第四十八頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)物品？質(zhì)控樣品？不同點應(yīng)用目的不一樣第四十九頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)物品？質(zhì)控樣品？具體操作做標(biāo)準(zhǔn)曲線，及相關(guān)指標(biāo)考察在分析樣品時，每分析多少個樣品進行一次質(zhì)控樣品分析，看分析方法的可靠性：控制分析質(zhì)量第五十頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化具體操作實際樣品測試就是實際樣品測試，類似于供試品測試；考察方法是否適合于實際樣品的測試第五十一頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化介質(zhì)效應(yīng)樣品存在除待測物質(zhì)以外的所有其它干擾物質(zhì)對響應(yīng)造成的直接或者間接影響質(zhì)控樣品池所有的質(zhì)控樣品，同未知樣品在相同條件下保存測試第五十二頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化未知樣品研究樣品，作為分析對象的體內(nèi)樣品制備樣品待測樣品經(jīng)過各步驟（如提取、純化、濃縮等）處理制成的、直接用于儀器分析的試樣第五十三頁，共77頁。CompanyLogo色譜條件優(yōu)化分析批包括未知樣品、適當(dāng)數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品和QC樣品的完整系列第五十四頁，共77頁。CompanyLogo方法

的驗證特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量下限準(zhǔn)確度與精密度穩(wěn)定性回收率分析過程的質(zhì)量控制未知樣品濃度超出范圍的處理相關(guān)物質(zhì)測定其它方法驗證第五十五頁，共77頁。CompanyLogo(一)、特異性

所測的物質(zhì)是原型藥物或特定的活性代謝物，內(nèi)源性物質(zhì)和響應(yīng)的其他代謝物及其他藥物不影響樣品的測定。空白血漿空白血漿＋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)受試血漿第五十六頁，共77頁。CompanyLogo第四節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證(二)、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍6.412.819.225.63232.41.81.20.60茶堿(μg/ml)·····Y=9.56610-2X+6.15310-3

r=0.9995至少6個濃度點建立標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍必須覆蓋全部待測濃度，不得外推最低濃度點偏差在±20%其余濃度點的偏差在±

15%。第五十七頁，共77頁。CompanyLogo(三)精密度與準(zhǔn)確度(四)定量下限(五)穩(wěn)定性(六)提取回收率(七)質(zhì)控樣品(八)質(zhì)量控制(九)測定結(jié)果第四節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證第五十八頁，共77頁。CompanyLogo液相色譜技術(shù)簡介講述原因同學(xué)們對液相色譜的相關(guān)理論認知不深，感覺抽象，給本課程學(xué)習(xí)帶來嚴(yán)重影響在本書中有大量的含量測定及雜質(zhì)限量方法會用到液相色譜方法希望給同學(xué)們今后從事藥物分析工作，讀研、讀博從事藥學(xué)研究提供一定的幫助第五十九頁，共77頁。CompanyLogo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜定義第六十頁，共77頁。CompanyLogo液相色譜技術(shù)簡介氣、液相色譜區(qū)別第六十一頁，共77頁。CompanyLogo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的結(jié)構(gòu)與原理第六十二頁，共77頁。CompanyLogo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的結(jié)構(gòu)高壓輸液系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)進樣系統(tǒng)第六十三頁，共77頁。CompanyLogo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的分離系統(tǒng)第六十四頁，共77頁。CompanyLogo液相色譜技術(shù)簡介液相色譜的基本概念固定相：固定相是色譜的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在色譜過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱色譜中一般稱為洗脫劑，薄層色譜時稱為展層劑。

第六十五頁，共77頁。CompanyLogo分配系數(shù)可由Langmuir方程得出

Kd---分配系數(shù)

q、c---溶質(zhì)在固相和液相中的濃度第六十六頁，共77頁。CompanyLogo保留時間（tR）和保留體積（V