分子生物學(xué)綜合性試驗講義

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分子生物學(xué)綜合性試驗

生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院

生物制藥研究所

分子生物學(xué)綜合性試驗教學(xué)小組

2023年12月

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分子生物學(xué)試驗內(nèi)容與流程

一、試驗內(nèi)容1、小鼠肝臟總RNA提取

2、RT-PCR、擴增產(chǎn)物電泳鑒定與純化3、擴增產(chǎn)物克隆

4、轉(zhuǎn)化子篩選與PCR鑒定5、重組質(zhì)粒提取與酶切鑒定

二、流程

日期試驗內(nèi)容

20/12：小鼠肝臟總RNA提取RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄、-20℃凍存

21/12:RT-PCR：PCR

RT-PCR產(chǎn)物電泳鑒定與回收

接種DH5α2

22/12

23/12

24/12

RT-PCR產(chǎn)物與T載體連接轉(zhuǎn)化、涂平板轉(zhuǎn)化子藍白斑篩選轉(zhuǎn)化子PCR鑒定重組子接種重組子質(zhì)粒制備重組子酶切鑒定

宿主菌感受態(tài)制備3

試驗要求與質(zhì)量控制

綜合試驗涉及的知識點和試驗技術(shù)眾多，為了培養(yǎng)學(xué)生嚴謹求實、科學(xué)求真之精神，并達到綜合試驗之最大成效，以下對本綜合試驗過程的要求進行說明，且納入試驗考核成績。

1、預(yù)習(xí)

試驗前須充分預(yù)習(xí)，要求隨機抽查時，每一位同學(xué)能夠明了的闡述整體試驗思路和具體的試驗項目、原理。

2、試驗過程

除了遵守學(xué)校與學(xué)院一般試驗紀律與要求外，還必需做到主動性、能動性與團隊精神相接合，利用有限的資源與時間得到最好的培訓(xùn)與試驗結(jié)果。為此，本綜合試驗將能否在規(guī)定時間內(nèi)完成試驗內(nèi)容作為衡量學(xué)生動手能力的關(guān)鍵指標之一，并作為考核結(jié)果記入試驗成績中。要達到此目的，同學(xué)們必需提前細心閱讀試驗講義，全面了解試驗內(nèi)容，透徹理解試驗原理，熟悉各個操作步驟，并在試驗過程中合理安排時間。

3、試驗原始記錄與結(jié)果整理

每天必需及時、真實、完整地記錄當(dāng)天所做試驗狀況，記錄試驗過程中的異常狀況，分析其原因，并將下述關(guān)鍵性試驗狀況整理于試驗記錄本上，并于當(dāng)天由帶教老師簽閱：

1）記錄日期、天氣2）試驗名稱、負責(zé)人3）原理（簡述）4）實際操作狀況5）試驗結(jié)果6）分析

4、綜合試驗報告

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須按下述規(guī)范撰寫、并提交綜合試驗報告（電子版及電子打印版）。1）封面：

見下一頁。2)論文內(nèi)容目錄中文摘要英文摘要前言材料與方法結(jié)果與探討

1．總RNA提取與RT-PCR：PCR產(chǎn)物電泳凝膠掃描圖、PCR產(chǎn)物回收電泳凝膠掃描圖。

2．RT-PCR產(chǎn)物克隆：轉(zhuǎn)化篩選平板照片3．重組子PCR鑒定：PCR鑒定電泳凝膠掃描圖4．重組質(zhì)粒提取與酶切鑒定：酶切鑒定電泳凝膠掃描圖

分子生物學(xué)綜合性試驗論文

小鼠β-actin基因的克隆

姓名：…………班級：…………學(xué)號：…………

生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院

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試驗一小鼠肝臟總RNA提取

試驗?zāi)康?/p>

1．把握真核細胞總RNA提取的方法與本卷須知2．了解真核細胞總RNA提取的原理

試驗原理

RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ)。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機制，已成為分子生物學(xué)研究的一個重要手段。利用提取的RNA人們可以對特定的基因表達進行定性和定量檢測，從分子水平確切的了解細胞生命活動的規(guī)律。

尋常一個典型的哺乳動物細胞約含有10-5μgRNA，其中約82%為rRNA（主要是28S、18S和5.8S、5S四種類型），16%為tRNA和核內(nèi)小分子RNA，2%為mRNA。這些高峰度的RNA，如rRNA的大小和序列確定，可通過凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分開。而mRNA雖然大小和核苷酸序列各不一致，從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但大多數(shù)真核細胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)組成的尾，其長度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸—纖維素[oligo(dT)]，使得mRNA可以利用親和層析法分開。這個群體編碼了所有由該細胞合成的多肽。

真核細胞總RNA制備方法有多種，包括異硫氰酸胍—氯化銫超速離心法、鹽酸胍—有機溶劑法、氯化鋰—尿素法、熱酚法以及Trizol試劑提取法等。目前試驗室提取總RNA的常用方法為異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和Trizol試劑提取法。異硫氰酸胍法制備真核細胞總RNA，是將已知最強的RNase酶抑制劑異硫氰酸胍、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解，加強了核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA和蛋白質(zhì)分開并進入溶液，RNA選擇性地進入無DNA和蛋白質(zhì)的水相，簡單被異丙醇沉淀濃縮。我們這次試驗采用的是Trizol試劑提取法。TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分開，并將RNA

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釋放到溶液中，同時還抑制RNA酶，防止RNA的降解。當(dāng)參與氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚使蛋白變性，可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分開開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。

RNA極不穩(wěn)定，易于降解，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩(wěn)定，故在提取RNA時關(guān)鍵因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力，因此，創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，嚴格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。

1．抑制內(nèi)源性RNA酶。

主要運用RNA酶抑制劑，目前常用的RNA酶抑制劑有：①RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑(RNasin)，它是從人胎盤分開的一種蛋白質(zhì)，可以與多種RNA酶緊湊結(jié)合形成非共價結(jié)合的復(fù)合物，使RNA酶失活。RNA酶抑制劑經(jīng)數(shù)次凍融后或放在氧化條件下應(yīng)棄之不用。RNA酶抑制劑不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯；②氧釩核糖核苷復(fù)合物，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物，是一種過渡態(tài)似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并高效抑制RNA酶活性。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物能猛烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必需用含0.1%羥基喹啉的苯酚屢屢抽提以除之；③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后續(xù)的RNA純化過程中經(jīng)離心除去；④異硫氰酸胍，它是強力的蛋白質(zhì)變性劑，在破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從細胞核中解離出來的同時也使RNA酶變性失活；⑤焦碳酸二乙酯(DEPC)，它是RNA酶猛烈抑制劑，但其作用并不是絕對的。DEPC主要用于材料和器皿的RNA酶處理；⑥其它化學(xué)試劑，如SDS、尿素等對RNA酶也有一定的抑制作用。

2．防止外源性RNA酶污染

外源性RNA酶主要通過以下幾個途徑污染RNA制品：①玻璃制品、塑料制品和電泳槽；②研究人員造成的污染；③污染的溶液。因此在試驗中必需采取以下措施抑制外源性RNA酶：①試驗室用的普通玻璃制品和塑料制品經(jīng)常有RNA酶污染，使用前必需于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿沖洗(塑料制品)。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌，用水沖洗，乙醇枯燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1TPC水完全沖洗電泳槽。滅菌

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的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理；②在RNA提取過程中,應(yīng)戴一次性手套和口罩,對接觸可能污染的器皿時，應(yīng)勤換手套；③配制的溶液的水應(yīng)用0.1TPC水在37℃處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對不能高壓滅菌的試劑，用經(jīng)DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制。

儀器與試劑

1．儀器與材料：

低溫高速離心機、移液器、DEPC水處理的EP管與槍頭、一次性手套、組織研磨棒、眼科剪、眼科鑷、止血鉗2．試劑：

Trizol試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇

試驗步驟

1.吸取500μLTrizol參與一新的DEPC處理后的1.5mLEP中；

2.解剖小鼠，取小鼠肝臟組織，在生理鹽水中清洗后，剪成大小約黃豆大?。ㄖ亓考s100mg）,放入已加有500μLTrizol的1.5mLEP中；

3.使用用組織研磨棒快速研磨4-5次，之后再參與500μLTrizol，繼續(xù)快速研磨2-3次研磨組織直至溶液變粘稠，室溫放置5min使其充分裂解；4.12000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至一新的DEPC處理后的1.5mLEP中；5.參與200μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置3min；6.12000rpm離心15min；

7.離心后混合物分為三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。防備移取上層無色水樣層，轉(zhuǎn)移至另一新EP管中；

8.參與500μL異丙醇，室溫放置15min；

9.12000rpm離心15min，這時會在EP管的底部看到白色沉淀；輕輕棄去上清；10.參與1mL75％乙醇（用DEPC處理的水配制）洗滌RNA沉淀；11.7500rpm離心5min,棄上清；12.將EP管倒置，枯燥，揮發(fā)剩余的乙醇；

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13.用適量DEPC處理的水溶解RNA沉淀，推薦20μL。

本卷須知

1.研磨組織塊用于RNA提取的樣品,必需是新鮮的細胞或組織,如采樣后,不能馬上用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。2.研磨過程中要盡量避免Trizol的溢出。

3.有屢屢離心過程，注意配平，防止出現(xiàn)事故以及對離心機的損害。4.整個抽提過程，要盡量避免RNase的污染，全程配戴一次性手套，皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物試驗操作習(xí)慣，預(yù)防微生物污染。

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試驗三RT-PCR產(chǎn)物克隆

試驗?zāi)康?/p>

1．把握DNA體外重組的原理與方法。

2．了解大腸桿菌氯化鈣法制備感受態(tài)的原理，把握制備的方法。3．把握大腸桿菌轉(zhuǎn)化原理與方法。

試驗原理

RT-PCR反應(yīng)之后，TaqDNA聚合酶一般會在目的基因的3’末端添加上一個A堿基，而T載體的3’末端附帶一個T堿基，擴增產(chǎn)物與T載體在連接酶的作用下，通過堿基互補配對作用，就可形成穩(wěn)固的重組克隆載體。

受體細胞經(jīng)過一些特別方法（如：電擊法、CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許帶有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞。之后采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ馆d體DNA分子進入受體細胞。本試驗通過42℃熱激、冰浴冷卻的方法將外源DNA載體分子轉(zhuǎn)化入宿主細胞內(nèi)。

儀器與試劑

1儀器

移液器（0.5-10微升、10-200微升，100-1000微升的量程）恒溫水浴鍋（16℃），冰盒，超凈工作臺，培養(yǎng)箱，搖床，玻璃試管，離心機，玻璃棒。2試劑

pMD19-T載體試劑盒，0.1MCaCl2。3菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌DH5α；LB(Amp-)培養(yǎng)基，含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板。

試驗步驟

1.PCR產(chǎn)物與T載體的連接

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（1）在清白的0.2ml的Eppendorf管中依次參與以下各組分：試驗組（每組做一個）：

ddH2O3μLSolutionⅠ5μLpMD19-T載體1μLPCR產(chǎn)物1μL總體積10μL

對照組(一個班做一個，第五組同學(xué)做)：

ddH2O3μLSolutionⅠ5μLpMD19-T載體1μLControlInsert1μL總體積10μL

（2）輕混反應(yīng)物，并在16℃或者室溫連接反應(yīng)30分鐘(時間可延長)。2.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備

（1）接種10μL甘油菌至含有2mlLB培養(yǎng)基（Amp-）的試管中，37℃振蕩

培養(yǎng)過夜。

注：前一步已經(jīng)由試驗中心老師準備好，同學(xué)們只需從下面其次步開始試驗。（2）以1%的接種量將甘油菌種30μL接種到3mlLB培養(yǎng)基（Amp-）中，

37℃振蕩培養(yǎng)3h(此時菌液的A600值達到0.3～0.4)；（示范操作）

（3）室溫下，以5000rpm離心2min，回收細胞；

（4）在超凈工作臺里用槍頭吸取上清棄掉，再用100μL預(yù)冷的0.1MCaCl2溶

液重懸菌體（重懸時操作要輕），冰浴放置。3.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化（無菌操作）

（1）將連接產(chǎn)物（試驗組和對照組）參與到制備好的感受態(tài)細胞里，用加樣槍

反復(fù)吹打，將質(zhì)粒與感受態(tài)細胞混合均勻，冰浴10min；（2）42℃水浴熱休克2min，時間到后迅速在冰上冷卻10min；（3）參與1mLLB培養(yǎng)基（Amp-），37℃靜置0.5~1小時；

（4）5000rpm離心2min，在超凈工作臺中用槍頭吸取800μL上清棄掉，用剩

余的液體將細胞懸浮；

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（5）將懸浮細胞全部吸取并轉(zhuǎn)移至含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板上，用

無菌玻璃棒涂布均勻，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

本卷須知：

1、吸取微量液體時務(wù)必要防備，確保將其全部轉(zhuǎn)移到反應(yīng)液中；2、確保反應(yīng)液混合均勻；

3、為提高轉(zhuǎn)化率，要密切注意細胞的生長狀態(tài)和密度。

結(jié)果分析與探討：

若轉(zhuǎn)化平板上未能長出菌落，說明轉(zhuǎn)化失敗，可能原因有：（1）與T-載體連接試驗失??；（2）所制備感受態(tài)細胞質(zhì)量差，重組載體未能成功轉(zhuǎn)入；（3）進入宿主菌的外源載體分子未能表達。

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試驗四轉(zhuǎn)化子的篩選及PCR鑒定

試驗?zāi)康?/p>

1．把握藍白斑篩選的基本原理及具體操作。

2．把握常見的幾種鑒定轉(zhuǎn)化子DNA的方法，以及菌落PCR鑒定的原理和方法。

試驗原理

現(xiàn)在使用的大量商業(yè)化質(zhì)粒載體(如pUC系列和它們的衍生載體)都帶有一段大腸桿菌DNA的短片段，其中含有β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼信息及調(diào)控序列。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它不破壞閱讀框，而不影響其功能。這種類型的載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的宿主細胞。盡管宿主和載體編碼的片段都沒有活性，但它們能夠融為一體，形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象稱為α互補。

IPTG（異丙基-β-D-半乳糖苷）是一種乳糖類似物，可使lacI阻遏蛋白失活，從而誘導(dǎo)lac操縱子轉(zhuǎn)錄。由α互補而產(chǎn)生的lac+細菌落易于識別，由于它們在生色底物X-gal存在的狀況下形成藍色菌落。然而外源DNA片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無α互補能力的N端片段。因此，攜帶重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。

這一簡單的顏色試驗，大大簡化了在這種構(gòu)建質(zhì)粒載體中鑒定重組子的工作，僅僅通過目測就可以輕而易舉地篩選數(shù)千個菌落，并識別可能含有重組質(zhì)粒的菌落。這樣的方法，即稱為藍白斑篩選法。

選擇性培養(yǎng)基上長出的菌落，由受體菌DH5α的表型Amp-轉(zhuǎn)變?yōu)锳mp＋（由質(zhì)粒提供抗性），且顏色為白色的菌落，證明重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化入受體菌，但要證明插入片段的大小和序列，還需進一步鑒定。常用方法之一是進行重組質(zhì)粒的抽提，然后電泳分析，觀測其分子量與原有載體相比是否增大；方法之二是將抽提的重組質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶分析，觀測酶切下來得到的DNA片段大小是否與預(yù)計的相符；方法之三是以重組質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，觀測PCR產(chǎn)物的大小是

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否與目的基因大小相符；方法之四則是將重組質(zhì)粒進行DNA序列分析，直接分析重組質(zhì)粒上的插入片段即目的基因的大小與序列是否正確。

本試驗將初篩得到的白斑菌落進行菌落PCR分析，觀測PCR得到的DNA片段大小是否與預(yù)計的相符，從而對重組轉(zhuǎn)化子DNA進一步鑒定。

儀器與試劑

1儀器

1.1涂布器，1個

滅菌試管若干超凈工作臺1臺空氣浴水平搖床1臺電泳儀及配套電泳槽1臺紫外檢測儀1臺1.2移液器（200-1000μL）1支

移液器（5-200μL）1支移液器（0.5-10μL）1支

2試劑

2.1LB（含Amp）液體培養(yǎng)基15mL

Amp的終濃度為0.1g/L（以1LLB/Amp液體培養(yǎng)基為例，Amp的含量為100mg。）2．2配置1LLB/Amp/X-Gal/IPTG平板培養(yǎng)基（舉例說明）：

終濃度試劑用量0.04mg/mLX-Gal40mg0.024mg/mLIPTG24mg1%(W/V)Tryptone10g0.5%(W/V)YeastExtract5g1%(W/V)NaCl10g0.1mg/mLAmpicillin100mg1.5%(W/V)Agar15g

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參與1mL70％的乙醇，用槍頭輕輕吹打洗滌沉淀，注意不要將沉淀打碎或吸走

12000r/min離心5分鐘，防備用棄去上清，注意不要將沉淀倒走

將EP管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然枯燥

用20μL含RNaseA的無菌蒸餾水溶解提取物，室溫放置，充分溶解DNA

2．酶切鑒定

在EP管內(nèi)參與酶切反應(yīng)體系（20μL）質(zhì)粒DNA10μL10×酶切反應(yīng)緩沖液2μLEcoRI1μLHindIII1μL無菌蒸餾水6μL

離心混勻，37℃水浴反應(yīng)3－4小時

制備1％的瓊脂糖凝膠板

取酶切后全部DNA樣品參與上樣緩沖液混勻

上樣進行瓊脂糖凝膠電泳

紫外監(jiān)測儀觀測結(jié)果

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2．3菌落PCR：

PCRBuffer、dNTPmix、Primer1#、Primer2#、TaqDNApolymerase、H2O、瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、上樣緩沖液、DNA染料

試驗步驟（以下操作均在超凈工作臺中進行）

1．藍白斑平板的制作（此步已由試驗準備老師完成，以下平板配置各試劑的劑量以1L為例進行說明）：

（1）稱取以下試劑，置于1L燒杯中。

Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g（2）參與約800mL的去離子水，充分攪拌混勻。（3）滴加5NNaOH(約0.2mL),調(diào)理PH值至7.0。（4）加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L后，參與15gAgar。（5）高溫高壓滅菌后，冷卻至60度左右。

(6)參與1mLAmpicillin(100mg/mL)、1mLIPTG（24mg/mL）、2mLX-Gal（20mg/mL）后均勻混合。

(7)鋪制平板（30-35mL培養(yǎng)基/90mm培養(yǎng)皿）。(8)4度避光保存,一般存放24小時后才開始使用。

(9)做轉(zhuǎn)化液涂布平板操作時，提前1-2小時將平板從4度冰箱取出，室溫避光溫育，以待涂布使用。

（10）見試驗三中具體轉(zhuǎn)化操作。

（11）次日從37度溫箱中取出平板觀測，藍色菌落即初步認定為未轉(zhuǎn)化菌，白色菌落初步認定為轉(zhuǎn)化子。2．菌落PCR：

（1）按順序在PCR管中參與

10XPCRBuffer2μL

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dNTPmix1.6μLPrimer1#1μLPrimer2#1μLTaqDNApolymerase0.5μL

ddH2O13.9μL

總體積20μL

（2）常溫下隨機挑揀一個轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的小槍頭挑取少量菌體；

先將小槍頭放入一支裝有約3mLLB（Amp+）培養(yǎng)基的試管中洗滌2-3次，然后將同一槍頭浸入裝有PCRmixture的PCR管中反復(fù)吹打以作擴增培養(yǎng)細菌用；另取一PCR管，先進行操作（2）的操作，但不加轉(zhuǎn)化子模板，作為陰性對照。將以上兩個PCR管微弱離心后，放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)程序：

94℃5min94℃30sec

61.5℃30sec30Cycle72℃1.5min72℃7min4℃

（3）取少量5μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖電泳分析。（4）紫外檢測儀下觀測并記錄擴增片段大小。

注意：電泳時需有標準DNA分子量Marker和不加模板的陰性對照樣品（5）上述操作（2）中的洗滌過有菌槍頭的試管，空氣搖床37℃,180-200rpm

過夜（12-14hr）擴增培養(yǎng)，以備后續(xù)試驗質(zhì)粒提取及酶切使用。

本卷須知

1．α互補篩選是十分可靠的，但并非永不出錯：外源DNA的插入并不總是激活β-半乳糖苷酶α片段的互補活性。假使外源DNA很小（小于100bp），或者插入片段沒有破壞編碼框，也沒有影響α片段的結(jié)構(gòu)，就可能不會嚴重影響α互補。雖然這種現(xiàn)象在文獻中有所報道，但是極為罕見，因此只對遇到這種問題的

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研究者才有意義。

不是所有的白色克隆都攜帶重組質(zhì)粒。Lac序列的突變或者丟失可能掩蓋質(zhì)粒表達α片段的能力。

2．PCR方法操作簡便,但影響因素較多,欲得到好的反應(yīng)結(jié)果,需根據(jù)不同的DNA模板,摸索最適條件。同時還要注意避免操作中每一步可能造成的人為污染。

結(jié)果分析與探討

1．LB/Amp/X-Gal/IPTG平板存放在4度避光的條件下，要使用時須提前1-2個小時取出，在室溫下溫育，以供涂布所用。

2．本次試驗中所用的質(zhì)粒為商品化的T載體pMD19-T,在試驗過程中會注意到，它的顏色指示，將不如pUC19等質(zhì)粒在藍白斑篩選中的顏色指示明顯。3．挑取轉(zhuǎn)化子菌落的時候，要注意挑取菌落的位置確鑿，沾取到平板上的些許瓊脂不太會影響試驗結(jié)果；用槍頭在裝有LB（Amp+）培養(yǎng)基的試管中上下2-3次即可，過分洗滌后，會造成PCR反應(yīng)模版不夠，影響試驗結(jié)果。

先

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試驗五重組質(zhì)粒提取與酶切鑒定

試驗原理

用NaOH和SDS破壞細菌包膜，并制造PH12.0~12.6的堿性環(huán)境，胞內(nèi)容物釋放出來后，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。當(dāng)參與高鹽的酸性乙酸鉀溶液后，PH值調(diào)至中性，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分DNA和蛋白質(zhì)在SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA依舊為可溶狀態(tài)。通過離心就可以除去大部分細胞碎片染色體DNA、RNA和蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，利用酚、氯仿、異丙醇、乙醇等試劑進一步純化質(zhì)粒DNA。

核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基序列的核酸水解酶，分I、II、III型三種，II型酶是我們分子生物學(xué)中最常用的內(nèi)切酶，試驗中使用的EcoRI和HindIII兩種內(nèi)切酶能夠識別質(zhì)粒上的特定DNA序列，并能在識別的序列內(nèi)切斷DNA雙鏈，形成一定長度的DNA片斷。

瓊脂糖凝膠電泳適用于分開0.2-50kb范圍的DNA片斷，因DNA分子帶負電荷，在電場中向正極移動，不同DNA分子所帶電荷數(shù)、分子量大小和構(gòu)象不同，在同一電場中的泳動速度就不一樣，從而達到分開的目的。

儀器與試劑1．質(zhì)粒提取試劑

1.1含質(zhì)粒DNA的過夜培養(yǎng)的DH5α菌株LB菌液1.5mL

1.2溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100mL,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱

1.3溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS。溶液Ⅱ需