細(xì)胞周期的調(diào)控與檢測(cè)

細(xì)胞周期及其調(diào)控機(jī)制蘇川南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系86862774江蘇省病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室86862773現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二提綱一、基本概念介紹二、歷史回顧三、細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)變化四、細(xì)胞周期的調(diào)控五、細(xì)胞周期得以進(jìn)行的兩大機(jī)制六、細(xì)胞周期的界面機(jī)制七、腫瘤與細(xì)胞周期八、常用的細(xì)胞周期檢測(cè)方法現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二

生命是如何生長(zhǎng)、生存、繁衍和死亡？在每一個(gè)生命個(gè)體中都存在一個(gè)精密的程序，或生物鐘。生物鐘決定著細(xì)胞是否、何時(shí)生長(zhǎng)、分裂、或死亡。這就是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，它在相關(guān)基因的控制下，依據(jù)一定的規(guī)則和節(jié)奏運(yùn)行著，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和死亡。在胚胎細(xì)胞，細(xì)胞周期保持快速運(yùn)行，在一些成年細(xì)胞中其運(yùn)行慢得多，而在神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞周期幾乎完全不運(yùn)行。在生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)胞，如果細(xì)胞周期不能運(yùn)行，結(jié)果是死亡。而在成熟細(xì)胞，細(xì)胞周期不正確的運(yùn)行，結(jié)果則是腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞周期(cellcycle)細(xì)胞周期調(diào)控(cellcycleregulation)“細(xì)胞周期”也稱(chēng)“細(xì)胞分裂周期”，是指一個(gè)細(xì)胞經(jīng)生長(zhǎng)、分裂而增殖成兩個(gè)所經(jīng)歷的全過(guò)程，通?？煞譃槿舾呻A段，即G1期、S期、G2期和M期。細(xì)胞在G1期完成必要的生長(zhǎng)和物質(zhì)準(zhǔn)備，在S期完成其遺傳物質(zhì)——染色體DNA的復(fù)制，在G2期進(jìn)行必要的檢查及修復(fù)以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，然后在M期完成遺傳物質(zhì)到子細(xì)胞中的均等分配，并使細(xì)胞一分為二。一、基本概念介紹現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二2001NobelPrizeLelandH.Hartwell1970s“Checkpoint”Yeastgenetics~100CDCgenesStartgeneTimHunt1980sCyclinsSeaUrchinsPaulM.Nurse1970sCDKsyeast二、歷史回顧現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二生命復(fù)制之謎的揭開(kāi)

（1）1858年建立細(xì)胞理論：生命的基本形式是細(xì)胞，機(jī)體由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞的生長(zhǎng)復(fù)制形成了生物體的生長(zhǎng)繁衍，細(xì)胞的異?；蛩劳鰧?dǎo)致機(jī)體的疾病或死亡。

（2）1951年發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞分裂周期：G1SG2MG0細(xì)胞生長(zhǎng)中有兩種形式----有絲分裂期和細(xì)胞間期細(xì)胞周期細(xì)胞間期有絲分裂期（M期）DNA合成前期（G1期）DNA合成期（S期）DNA合成后期（G2期）前期中期后期末期現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二細(xì)胞分裂周期圖現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二（3）隨著成熟刺激因子（maturationpromotingfactor,MPF），細(xì)胞周期素（cyclin），細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶(cyclin

dependentkinase，CDK)的發(fā)現(xiàn)使對(duì)細(xì)胞周期及與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究有了很大進(jìn)展現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二三、細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)變化１、G1期（DNA合成前期，指有絲分裂完成到DNA合成之前的一段時(shí)間）

RNA在此期大量合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)量明顯增加。S期所需的DNA復(fù)制相關(guān)的酶系，如DNA聚合酶，G1期向S期轉(zhuǎn)變相關(guān)的蛋白質(zhì)如觸發(fā)蛋白、鈣調(diào)蛋白、細(xì)胞周期蛋白等均在此期合成。蛋白質(zhì)的磷酸化作用在G1期開(kāi)始增加，，這將有利于G1晚期染色體結(jié)構(gòu)成分的重排。非組蛋白、一些蛋白激酶在G1期也可發(fā)生磷酸化，已知大多數(shù)蛋白激酶磷酸化發(fā)生于其絲氨酸或蘇氨酸、酪氨酸部位。

現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二觸發(fā)蛋白是一種不穩(wěn)定蛋白，它對(duì)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期是必須的。只有當(dāng)其含量積累到臨界值，細(xì)胞周期才能朝DNA合成方向進(jìn)行。鈣調(diào)蛋白是真核細(xì)胞內(nèi)重要的鈣受體，它調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的水平，鈣調(diào)蛋白的含量，在G1晚期可達(dá)峰值，用抗鈣調(diào)蛋白藥物處理細(xì)胞，可延緩其從G1期到S期的進(jìn)程。G1期蛋白質(zhì)量的增加，可能與蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)有關(guān)，而另一原因則可能使其降解的減弱?，F(xiàn)在是12頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二２、S期（DNA合成期，從DNA合成開(kāi)始到DNA合成結(jié)束的全過(guò)程，是細(xì)胞增殖周期的關(guān)鍵階段）S期是細(xì)胞進(jìn)行大量DNA復(fù)制的階段，組蛋白及非組蛋白也在此期大量合成，最后完成染色體的復(fù)制（１）DNA復(fù)制需要多種酶的參與包括DNA聚合酶、DNA連接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸還原酶等。隨著細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，這些酶的含量或活性可顯著增高（２）DNA復(fù)制具有嚴(yán)格的時(shí)間順序通常，GC含量較高的DNA序列在早S期復(fù)制，晚S期復(fù)制的主要為ＡＴ含量高的DNA序列；就染色體而言，常染色質(zhì)的復(fù)制較異染色質(zhì)要早，典型的例子如人女性的細(xì)胞中，當(dāng)其它染色體都被復(fù)制完以后，才開(kāi)始進(jìn)行純化的X染色體復(fù)制。現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二（３）S期是細(xì)胞合成的主要時(shí)相

此時(shí)細(xì)胞質(zhì)中可出現(xiàn)大量的組蛋白mRNA，新合成的組蛋白從胞質(zhì)進(jìn)入胞核，與復(fù)制后的DNA迅速結(jié)合，但繞成核小體，進(jìn)而形成具有兩條單體的染色體。除了蛋白質(zhì)合成以外，在S期細(xì)胞中不斷進(jìn)行著組蛋白的持續(xù)磷酸化。（４）中心粒的復(fù)制也在S期完成

原本垂直的一對(duì)中心粒發(fā)生分離，各自在其垂直方向形成一個(gè)子中心粒，由此形成的兩對(duì)中心粒在以后的細(xì)胞周期進(jìn)程中，將發(fā)揮微管組織中心的作用，紡錘體微管，星體微管的形成均與此相關(guān)?，F(xiàn)在是14頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二３、G2期（DNA合成后期，從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開(kāi)始前的時(shí)期，為有絲分裂

進(jìn)行物質(zhì)條件）

為細(xì)胞分裂準(zhǔn)備期，細(xì)胞中合成一些與M期結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，與核膜破裂，染色體凝集相關(guān)的成熟促進(jìn)因子在此期合成。微管蛋白G２期合成達(dá)高峰，為M期紡錘體微管的形成提供了豐富的來(lái)源。已經(jīng)復(fù)制的中心粒在G2期逐漸長(zhǎng)大，并開(kāi)始向細(xì)胞兩極分離。４、M期（有絲分裂期，細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂將染色體平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中）在此期細(xì)胞中，染色體凝集后發(fā)生姊妹染色單體的分離，核膜核仁破裂后再重建，胞質(zhì)中有紡錘體收縮環(huán)出現(xiàn)，隨著兩個(gè)子核的形成，胞質(zhì)也一分為二，由此完成細(xì)胞分裂?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二G1期：為DNA合成準(zhǔn)備所需要的RNA、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、糖類(lèi)等G1早期：細(xì)胞的生長(zhǎng)G1晚期：為S期的DNA合成做準(zhǔn)備S期（DNA合成期）

DNA合成(復(fù)制)染色體蛋白的合成：組蛋白、非組蛋白等中心粒的復(fù)制G2期（DNA合成后期）有活躍的RNA和蛋白質(zhì)合成微管蛋白，促有絲分裂因子（MPF）中心粒向兩極移動(dòng)M期（有絲分裂期）

DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成停止。細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)變化、結(jié)構(gòu)建成。將加倍的DNA平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二細(xì)胞周期調(diào)控研究過(guò)程的重要事件---MPF的發(fā)現(xiàn)：MPF是一種在G2期形成，能促進(jìn)M期啟動(dòng)的調(diào)控因子，稱(chēng)之為促細(xì)胞成熟因子或促細(xì)胞分裂因子（MPF)。MPF由調(diào)節(jié)亞單位細(xì)胞周期素（cyclin）和催化亞單位細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶（CDK）組成。1、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白（cellcycle-regulatingprotein)四、細(xì)胞周期的調(diào)控現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二2）細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的種類(lèi)A、CDK類(lèi)蛋白激酶：CDK與細(xì)胞周期素結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase，CDK).作用：CDK可將特定蛋白磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行。在動(dòng)物中已知7種CDK，CDK1-7。B、細(xì)胞周期素（cyclin)特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。作用：能與CDK結(jié)合，激活CDK，間接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行。已知30余種，在脊椎動(dòng)物中為cyclinA1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二Cyclins與CDKs結(jié)合后，CDKs才具有活性，它們兩者的結(jié)合使細(xì)胞周期有序進(jìn)行。具體結(jié)合方式如下：現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二C、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子(CKI)CKI對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：Ink4:P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。特異性抑制cdk4-cyclinD1,cdk6-cyclinD1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。作用機(jī)制：未完全清楚，大多數(shù)CKI是通過(guò)直接與Thr160/161磷酸化后的CDK-cyclin復(fù)合物密切結(jié)合，直接抑制其蛋白激酶活性。現(xiàn)較為肯定的是p21，其調(diào)控水平在基因轉(zhuǎn)錄的層面，當(dāng)DNA損傷和細(xì)胞衰老時(shí)，具有轉(zhuǎn)錄因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)行?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結(jié)合M-cyclin的CDK1被Wee1（抑制因子）將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25磷酸酶使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CAK)的作用下完成的。3）M期CDK的激活現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二CDKactivating活性位點(diǎn)抑制位點(diǎn)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二由于某些環(huán)境因素的作用細(xì)胞周期出現(xiàn)故障或差錯(cuò)，這些信號(hào)可是細(xì)胞停留在某些點(diǎn)上，稱(chēng)為限制點(diǎn)。主要檢驗(yàn)點(diǎn)：G1/S限制點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？在酵母中稱(chēng)start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱(chēng)R點(diǎn)(restrictionpoint)。S期限制點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？G2/M限制點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？中-后期限制點(diǎn)：紡錘體組裝限制點(diǎn)。2、細(xì)胞周期限制點(diǎn)（checkpoint）現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二Fourcheckpoints現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二3、細(xì)胞周期中的信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控

單細(xì)胞生物的增殖取決于營(yíng)養(yǎng)，多細(xì)胞生物細(xì)胞的增殖與信號(hào)途徑有關(guān)。A、生長(zhǎng)因子：是與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號(hào)物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，又稱(chēng)有絲分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：旁分泌。信號(hào)通路：ras途徑，cAMP途徑、磷脂酰肌醇途徑。B、抑素（chalone)是一種由細(xì)胞自身產(chǎn)生、分泌的，對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用的糖蛋白，與膜上的受體結(jié)合，引起信號(hào)轉(zhuǎn)換及在胞內(nèi)傳遞，影響細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白的表達(dá)。具有嚴(yán)格的組織特異性和細(xì)胞周期階段特異性。作用于G1期的抑素可阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，稱(chēng)S因子。作用于G2期的抑素可阻止細(xì)胞進(jìn)入M期，稱(chēng)M因子?，F(xiàn)在是26頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二五、細(xì)胞周期得以進(jìn)行的兩大機(jī)制

細(xì)胞周期得以進(jìn)行的核心機(jī)制是在一系列cyclin時(shí)相起伏的調(diào)控下，相應(yīng)的CDK依次激活，驅(qū)使細(xì)胞通過(guò)G1,S,G2期，達(dá)到M期，細(xì)胞一分為二，實(shí)現(xiàn)忠于親代的細(xì)胞復(fù)制。這一過(guò)程的順利完成取決于是否啟動(dòng)和能否忠于運(yùn)行，達(dá)到忠實(shí)復(fù)制，是細(xì)胞周期調(diào)控的兩大生物學(xué)機(jī)制。現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二1、細(xì)胞周期的啟動(dòng)機(jī)制

細(xì)胞周期能否啟動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞增殖，主要的調(diào)控點(diǎn)在G1期，它決定細(xì)胞是否通過(guò)G1期進(jìn)入S期。這一調(diào)控點(diǎn)首先在芽殖酵母的研究中被認(rèn)識(shí)，人們稱(chēng)其為“起始點(diǎn)”（START）。一旦細(xì)胞通過(guò)start,它們勢(shì)必進(jìn)入S期，完成整個(gè)細(xì)胞分裂周期。因此start有人稱(chēng)之為酵母細(xì)胞周期的“決定點(diǎn)”。在人體細(xì)胞增殖中，在G1期存在相似的調(diào)控機(jī)制。在G1期較晚時(shí)，也有一個(gè)決定點(diǎn)，稱(chēng)為“限制點(diǎn)”（restrictionpoint），與酵母的START功能類(lèi)似，不同的是，人類(lèi)細(xì)胞是否通過(guò)“限制點(diǎn)”，進(jìn)入細(xì)胞周期，主要受與細(xì)胞增殖有關(guān)的細(xì)胞外生長(zhǎng)因子的調(diào)控，而不是營(yíng)養(yǎng)素。只要有相應(yīng)的生長(zhǎng)因子存在，細(xì)胞就能通過(guò)R點(diǎn)進(jìn)入S期，完成整個(gè)細(xì)胞周期?；氐紾0/1期。相反，如果細(xì)胞在G1期就缺乏相應(yīng)的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞周期的運(yùn)行將停止在R點(diǎn)，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)入“安靜狀態(tài)，稱(chēng)之為G0期?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞周期有兩條途徑，一是cyclin－D/CDK4，二是cyclinE/CDK2。二者都是G1期進(jìn)行的限速步驟，即cyclinD或cyclinE的過(guò)度表達(dá)，均能縮短G1期時(shí)間或加速G1期進(jìn)行現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二2、細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制

DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)抑癌基因p53在人類(lèi)細(xì)胞周期G1期檢測(cè)點(diǎn)起著關(guān)鍵性作用。還存在G2期檢測(cè)點(diǎn)。時(shí)相次序監(jiān)測(cè)點(diǎn)MPF(有絲分裂促進(jìn)因子)，可以誘導(dǎo)所有細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞核發(fā)生染色體凝集。SPF(S期促進(jìn)因子)，只能誘發(fā)G1期細(xì)胞進(jìn)入S期而不能使G2期細(xì)胞進(jìn)入M期?，F(xiàn)在是30頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二六、細(xì)胞周期的界面機(jī)制1、細(xì)胞周期與DNA修復(fù)所有的真核細(xì)胞中都高度保守者這一整套完整的精密機(jī)制，承擔(dān)著DNA損傷、錯(cuò)誤地發(fā)現(xiàn)，并將其信號(hào)傳遞給相應(yīng)的機(jī)制，，去阻滯細(xì)胞周期的運(yùn)行，并同時(shí)進(jìn)行DNA損傷的修復(fù)。然后視修復(fù)情況，細(xì)胞基因的突變。決定繼續(xù)分裂或死亡，執(zhí)行一系列細(xì)胞的重要生命活動(dòng)。DNA修復(fù)方式切除修復(fù)錯(cuò)配修復(fù):將局部一段錯(cuò)配的寡核苷酸鏈切除，重新合成之堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)全基因組切除修復(fù)轉(zhuǎn)錄切除修復(fù)現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二2、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡存在有細(xì)胞周期特異性，不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生在細(xì)胞周期不同的時(shí)相3、細(xì)胞周期與細(xì)胞分化細(xì)胞周期不僅與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡有關(guān)，還調(diào)控著細(xì)胞分化現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二1、細(xì)胞周期與腫瘤的關(guān)系目前從多方面對(duì)腫瘤進(jìn)行了深入研究（流行病學(xué)、病因?qū)W、遺傳），腫瘤是多因素，多步驟，多階段的。但是腫瘤的惡性增生從生物學(xué)角度看，主要表現(xiàn)在兩方面：一是腫瘤細(xì)胞的不滅性，即細(xì)胞凋亡障礙；二是細(xì)胞增殖失控，程序發(fā)生紊亂，只是增殖超常加快。這兩方面均已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展研究的熱點(diǎn)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了1.存在于正常細(xì)胞內(nèi)的原癌基因發(fā)生錯(cuò)誤轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?.一些基因失活后正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞—抑癌基因。經(jīng)過(guò)70年代的癌基因時(shí)代，80年代的抑癌基因時(shí)代90年代的多基因時(shí)代或癌基因蛋白網(wǎng)絡(luò)時(shí)代，提出了一系列的理論：腫瘤多步驟里論、DNA修復(fù)理論、細(xì)胞凋亡理論，進(jìn)一步闡明細(xì)胞周期核心機(jī)制、細(xì)胞周期啟動(dòng)機(jī)制、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)機(jī)制。七、腫瘤與細(xì)胞周期現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二2、

腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期檢控機(jī)制的破壞細(xì)胞周期中檢測(cè)DNA損傷的檢測(cè)點(diǎn)至少有兩處：一處在G1-S過(guò)渡期：控制進(jìn)入S期的檢測(cè)點(diǎn)，防止DNA受損細(xì)胞進(jìn)入S期的DNA復(fù)制。另一處在G2-M過(guò)渡期：控制進(jìn)入M期的檢測(cè)點(diǎn)，防止受損的DNA和未完成復(fù)制的DNA進(jìn)入有絲分裂。這些DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)的主要機(jī)制有二：一是p53依賴(lài)性機(jī)制，另一是p53非依賴(lài)性機(jī)制每一個(gè)完整的檢測(cè)點(diǎn)應(yīng)由四部分組成，即發(fā)現(xiàn)或傳感器（detect或sensor）、制動(dòng)或拘留（stoporarrest）、修復(fù)（repair）、決定（decision，divideordeath）。理論上說(shuō)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的任何一部分出了問(wèn)題，都會(huì)導(dǎo)致功能的異常，結(jié)果是遺傳不穩(wěn)定，基因受損的細(xì)胞存活和復(fù)制或細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變，如此細(xì)胞多步驟進(jìn)化，最終成為失控性生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)在是34頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二3、腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制的破壞細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能的減弱，導(dǎo)致突變基因的累積和正常細(xì)胞的進(jìn)化，只有當(dāng)這些累積的突變基因破壞了細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制，細(xì)胞才能進(jìn)入失控性生長(zhǎng)的境界。人們把細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制比作一輛汽車(chē)或引擎，驅(qū)使其運(yùn)行的因素好比“油門(mén)”；制動(dòng)器運(yùn)行的機(jī)制猶如“剎車(chē)”。持續(xù)地踏住“油門(mén)”或“剎車(chē)”失靈，終將失控。這正是致變因素導(dǎo)致基因突變，檢測(cè)點(diǎn)基因突變，突變基因累積，驅(qū)動(dòng)機(jī)制失控的必然結(jié)果。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，監(jiān)控機(jī)制破壞的典型例子是P53.基因的突變。大約50%的人類(lèi)腫瘤都存在P53.基因的突變，說(shuō)明DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，具有重要的位置。現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二From:BritishJ.Cancer87:129-133現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二1:222-231MutationofG1/Sregulatorsinhumancancer現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二八、常用的細(xì)胞周期檢測(cè)方法流式細(xì)胞術(shù)PI(碘化丙錠),可以與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合,采用RNA抑制劑將RNA消化后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同,因此,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期,S期和G2/M期,并可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率:G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N),G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N),S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。值得注意的是,PI不能通過(guò)細(xì)胞膜完整的細(xì)胞(如活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞),在標(biāo)本制備時(shí),必須先用乙醇或其他破膜劑增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性,才能使PI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合。乙醇通常為終濃度為70%的冷乙醇?，F(xiàn)在是38頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

PurdueUniversityCytometryLaboratories現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二G1SphaseG2MG1121DNAcontentTheCellCycleDNAcontentbyflowcytometryDeconvolutionintocellcyclephasesG0/1G2/MSEvents現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二MeasurementofsubG0/1apoptoticparticlesDNAcontentEventsEventsG0/1G2/MSApoptosis現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有45頁(yè)\編輯于星期二4hr,control28hr,irradiatedG1:94.1%S:1.5%G2/M:4.4%G1:94.1%S:1.1%G2/M:4.8%G1:60.6%S:34.9%G2/M:4.5%G1:96.6%S:1.6%G2/M:1.8%10