植物細胞融合實驗課件

第六章植物細胞融合（實驗）一、細胞融合的目的和意義

細胞融合能實現(xiàn)遠緣雜交。其意義在于打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，有可能形成有性雜交方法無法獲得的新型雜種植物，廣泛組合各種基因型，擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。二、細胞融合（cellfusion)概念在外力（誘導劑或促融合劑）作用下，兩個或兩個以上的異源細胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象。

通過細胞培養(yǎng)技術(shù)，這個細胞有可能發(fā)育成完整的生物個體，這個雜種后代有可能兼有兩個上代的一些優(yōu)良性狀。三、細胞融合技術(shù)原理和方法

由于體外培養(yǎng)的細胞很少會發(fā)生自發(fā)融合（融合頻率大約在10-4~10-6之間），因此要采用生物、化學或物理的方法人為地促使細胞融合。

促細胞融合的方法有：

（一）病毒促進細胞融合

其中仙臺病毒（HVJ）是最早用于動物細胞融合的融合劑。

（二）化學融合劑促進細胞融合

主要包括鹽類融合劑、聚乙二醇（PEG）、二甲亞砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸鹽、脂質(zhì)、Ca2+配合物等。

（三）電處理融合法聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG)融合

在眾多的化學試劑中，PEG應用最為廣泛，因PEG液比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便、而且促進細胞融合的能力更強。PEG是一種多聚化合物。

在原生質(zhì)體細胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內(nèi)蛋白質(zhì)顆粒易位并凝聚。接著可能是相鄰的剝?nèi)サ鞍踪|(zhì)的細胞膜間的類脂質(zhì)與類脂質(zhì)反應。繼之，類脂質(zhì)分子的擾動和重排導致接觸的細胞膜局部發(fā)生融合，形成很小的細胞質(zhì)橋，之后它逐漸擴大，兩個原生質(zhì)體最終融合。

使用化學促融劑時，Ca2+是必需的。關(guān)于Ca2+的作用機理，有的認為是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成為細胞間的鈣橋，由此引起融合。也有解釋為Ca2+結(jié)合到帶負電磷脂的電離基上，使磷脂分子在膜上相互分離，由此引起融合。電融合（electrofusiontechnique)法：

電處理融合法是20世紀80年代發(fā)展起來的細胞融合技術(shù)，使融合率大為提高。電融合過程的分子機制：

是以電降解及雙向電泳的聯(lián)合作用為基礎。通過電泳，兩細胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質(zhì)分子分離，產(chǎn)生了無蛋白的類脂區(qū)。電脈沖作用時引起膜結(jié)構(gòu)局部擾亂，出現(xiàn)小孔洞。而相對的脂雙層間分子在范德華力作用下，形成脂分子橋。由于連接處的細胞膜表面曲率大，處于高張力狀態(tài)，在熱力學上是不穩(wěn)定的，所以最終導致兩細胞逐漸融合成一個圓形的大球狀細胞。AAlignment:Cellsarebroughtintoclosecontactbymeansofdielectrophoresis.BFusionpulse:Asquarewavepulseofamere15microsecondsisappliedinordertopermeatethemembrane.Themembranesthenfuse.CHeterokaryonphase:Thecellmembranesarefusedcompletelyandthecytoplasmhasmixedtogether.Onlythenucleiremainseparate.DEntirefusionproduct:Thenucleiarenowfusedaswell.Asarule,thenumberofchromosomesisreduced.

實際操作：

先把待融合的細胞或原生質(zhì)體混合，取樣置于100V/cm的高頻交流電場中，在非均勻交流電場中形成項鏈狀排列；

完整煙草原生質(zhì)體（40×）

原生質(zhì)體成串（40×）

再用1~5V/cm直流電脈沖/微秒沖擊細胞或原生質(zhì)體的粘接點，細胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之間形成通道，使細胞質(zhì)得以交換；最后導致新的球狀細胞的形成。電融合法優(yōu)點（與PEG法比較）：

1、融合率高；

2、重復性強；

3、誘導僅發(fā)生在質(zhì)膜接觸部位，對細胞或原生質(zhì)體傷害?。?/p>

4、融合是在同步狀態(tài)下進行，活細胞數(shù)目多；

5、裝置精巧，方法簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程；

6、免去PEG誘導后的洗滌過程，誘導過程可控制性強。Electrofusion2.試劑

1）酶混合液

配制分兩部進行：

（1）將CaCl2.2H2O7mmol/L

NaH2PO4.2H2O0.7mmol/L

MES3mmol/L

甘露醇0.5mmol/L

用重蒸餾水溶解，調(diào)pH5.6，定容為酶儲備液，滅菌備用。（2）使用時再加入：

纖維素酶R-100.8%

果膠酶R-101%

因酶制劑經(jīng)過高壓滅菌處理后會失活，故先將酶儲液滅菌，待用時再將酶制劑按比例加入到第一步已滅菌的酶液內(nèi)。2）配制CaCl2.2H2O0.16mol/L

（pH5.8-6.2用于懸浮原生質(zhì)體）

3)PEG液：

30%（w/v)PEG(MW=6000)

CaCl2.2H2O0.01mol/L

kH2PO40.00074mol/L

山梨醇0.1mol/L

調(diào)pH5.8-6.2；用時現(xiàn)配！3.儀器

1）大型儀器：

高壓滅菌鍋，超凈工作臺，離心機，倒置顯微鏡，電融合儀。2）一般實驗用品

大小培養(yǎng)皿，小燒杯，小滴管，刻度離心管，小漏斗，不銹鋼網(wǎng)300目4.觀察酶解效果5.原生質(zhì)體的分離和純化1）酶解后，用300目銅網(wǎng)過濾酶液，去除未酶解的雜質(zhì)，將濾液收集在10ml離心管中。2）1000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，用吸管或移液槍棄上清（注意不要把收集的原生質(zhì)體吸走）。3）用CaCl2.2H2O

（約1ml）懸浮下面的原生質(zhì)體（PEG法）；電融合法則用電融合液懸浮。4）顯微鏡觀察提純后的原生質(zhì)體，若雜質(zhì)較多可重復1）～3）操作。純化的原生質(zhì)體圖示完整洋蔥原生質(zhì)體（40×）

完整煙草原生質(zhì)體（40×）6.原生質(zhì)體的密度測定用血細胞記數(shù)板記數(shù)。每一樣品測定3次，根據(jù)測定結(jié)果，將懸浮原生質(zhì)體密度調(diào)整至5*105個/ml。7.原生質(zhì)體的融合（一）PEG法1）配制PEG液（5ml）

30%（w/v)PEG(MW=6000)1.5gCaCl2.2H2O0.0074gkH2PO40.0005

g

山梨醇0.0911g

調(diào)pH5.8～6.22）將兩種原生質(zhì)體懸液等量混合3）用刻度吸管將混合的原生質(zhì)體懸液滴在直徑為60mm的平皿中，每皿7~8滴，每滴約0.1ml。然后靜置10分鐘，使原生質(zhì)體貼在皿底上，形成一薄層（應有3~5個平皿的重復）。4）用吸管將等量的PEG溶液緩慢地加在原生質(zhì)體液滴上，再靜置10~15分鐘。此時可取一個平皿在倒置顯微鏡上觀察原生質(zhì)體間的粘連。PEG法原生質(zhì)體的融合圖示1、煙草葉肉和洋蔥根尖細胞原生質(zhì)體融合（40×）

2、煙草葉肉和洋蔥根尖細胞原生質(zhì)體的異源融合

（二）電融合法1）融合儀參數(shù)設置：成串電流頻率0.5MHz,電壓30V,成串時間1min,融合脈沖幅寬40μS,融合電壓150v,融合槽間距1mm2）在融合小室中加入約100ul的原生質(zhì)體懸浮液，將融合小室接好電極后至于倒置顯微鏡下，靜置約3min，使懸浮的原生質(zhì)體沉降到平板底部，同時打開成串脈沖輸出開關(guān)及融合脈沖輸出開關(guān)，使高壓脈沖發(fā)生電路與融合小室接通。然后輕觸脈沖觸發(fā)開關(guān)，施加3次融合脈沖，每次間隔1s。融合脈沖后成串脈沖再保持1min。靜置融合小室20～30min，在顯微鏡下觀察融合過程。電融合法原生質(zhì)體的融合結(jié)果原生質(zhì)體成串（40×）原生質(zhì)體融合（圖1）電融合法原生質(zhì)體的融合結(jié)果

原生質(zhì)體融合（圖2）

原生質(zhì)體融合（圖3）OverallaimsofresearchTo“capture”diseaseresistancefromwildpotatospeciesTousesegregatingpopulationstoidentifyplantdiseaseresistancegenesandtransferresistanceintopotatocultivarsSOMATICHYBRIDIZATIONINSOLANUMSomatichybridizationusingprotoplastfusionIsolateprotoplasts(typicallyleafmesophyll)fromtwoparentallinesFuseprotoplastseitherchemically(PEG)orusingelectrofusionCellmembranesfuseformingonecellcontaining2nucleiOncelldivisionnuclearmaterialcondensestogetherandhybridscellsareformedthatcontainDNAfrombothparentallines.

PotatoplantsgrowinginatesttubeFreshlyisolatedpotatoprotoplastsTwoprotoplastsreadytofusetogether

FusionproductsbegintodivideonnutrientmediumIftheconditionsareright,smallshootsemergefromthegreencalliPutativesomatichybridplants

Afertilesomatichybrid

Phenotypeofsomatichybridsclearlyshowscharacteristicsofbothparents

S.brevidenssomatichybridS.tuberosumPhenotypeofintraspecificdiploidsof

S.tuberosum

US-W9310.3SomatichybridUS-W9545.99SomatichybridshaveALLofthechromosomesfromeachparentplant

VerticilliumwiltresistancetestfieldatHancock,Wisconsin

LateblightresistanceinbackcrossplantderivedfromsomatichybridsbetweenS.bulbocastan