微生物學(xué)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)細(xì)菌耐受噬菌體突變率測(cè)定課件

1細(xì)菌耐受噬菌體突變率的測(cè)定

——微生物創(chuàng)新性試驗(yàn)第五組：2

細(xì)菌耐受噬菌體的突變是一種自發(fā)突變，它的發(fā)生與環(huán)境因子無關(guān)，是隨機(jī)的非定向突變。本組設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)題目：

測(cè)定銅綠假單胞菌耐受噬菌體的突變頻率3研究背景本菌為條件致病菌，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一?；即x性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，及術(shù)后或某些治療后的患者易感本菌。篩選出優(yōu)良菌種，以便更好地利用其資源進(jìn)行研究并造福人類。同時(shí)又對(duì)其外界環(huán)境有更大的適應(yīng)性，更好應(yīng)用于發(fā)展、生產(chǎn)的需要。為獲得其菌群，我們采用利用噬菌體將其敏感細(xì)菌殺死，從而選擇耐受細(xì)菌。56研究概述研究方案：為獲得其菌群，我們采用噬菌體將敏感細(xì)菌殺死，將發(fā)生了耐受突變的細(xì)菌選擇出來，并繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群。研究意義：培養(yǎng)出優(yōu)勢(shì)菌群，為以后臨床治療及臨床用藥起輔助性作用。研究目的：測(cè)定細(xì)菌自然情況下耐受噬菌體的自發(fā)突變頻率。研究問題：突變率測(cè)定實(shí)驗(yàn)材料1.毒性噬菌體及其相應(yīng)的敏感宿主菌。

（建議使用人體正常菌群中的細(xì)菌及其噬菌體，如大腸埃希菌或銅綠假單胞菌及其相應(yīng)噬菌體。）2.LB液體培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基。3.試管、培養(yǎng)皿、刻度定量吸管。4.酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、普通培養(yǎng)箱等。7實(shí)驗(yàn)步驟91.準(zhǔn)備好銅綠假單胞菌的過夜培養(yǎng)物和相應(yīng)的噬菌體原液（噬菌體效價(jià)10^10）銅綠假單胞菌的倒置過夜培養(yǎng)物噬菌體原液實(shí)驗(yàn)步驟2.將菌液10倍連續(xù)稀釋，至少稀釋7管，取0.1ml涂布接種LB瓊脂平板，37度培養(yǎng)過夜。次日取菌落適宜于菌落計(jì)數(shù)的平板進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的CHU數(shù)：

CFU數(shù)=每個(gè)平皿中的CFU數(shù)×10×血清稀釋倍數(shù)102.1110倍連續(xù)稀釋，至少7管通俗的解釋是指每毫升菌液中含有多少單細(xì)胞。傳統(tǒng)上就叫“個(gè)”。但是，我們知道，一個(gè)菌落不一定是一個(gè)細(xì)菌所生成，也可能是由一簇細(xì)菌（一個(gè)細(xì)菌團(tuán)）所生成，這時(shí)候再叫“個(gè)”就不太準(zhǔn)確啦，準(zhǔn)確的叫法就是“菌落形成單位”，英文縮寫“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，數(shù)量上沒有變化。13實(shí)驗(yàn)步驟3.進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，菌數(shù)約為10^9CFU/ml左右。

2~3h后，可見菌液逐步變清，待完全變清（月4h之內(nèi)），將全部菌液均勻涂布到一個(gè)LB瓊脂平板上，置37℃下培養(yǎng)過夜。次日計(jì)數(shù)CFU。144.耐受噬菌體突變頻率的計(jì)算第3步中獲得的CFU數(shù)為1ml菌液中的耐受菌數(shù)量，第2步中獲得的CFU數(shù)為1ml菌液中的總菌數(shù)。故：

耐受噬菌體突變頻率=15第3步中獲得的CFU數(shù)第2步中獲得的CFU數(shù)2.分離培養(yǎng)容易本菌生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高。3.生長(zhǎng)特點(diǎn)明顯該菌在4℃不生長(zhǎng)而在42℃可以生長(zhǎng)。（可用以鑒別）4.采用CFU計(jì)數(shù)的科學(xué)性。5.實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，便于觀察。17預(yù)期結(jié)果18稀釋度10-110-2…10-7123平均123平均…123平均CFU數(shù)/平板

…

每毫升的CFU數(shù)

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預(yù)期結(jié)果經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)測(cè)：

銅綠假單胞菌耐噬菌體的突變機(jī)率在1.4×10^-7～7.9×10^-7之間。19思考題(1)為什么溶化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板？(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵？為什么？(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)。21參考文獻(xiàn)《微生物學(xué)通報(bào)》MICROBIOLOGY

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)：ISSN0253-2654