考馬斯亮藍(lán)法測定（試驗(yàn)報(bào)告）

本文格式為Word版，下載可任意編輯——考馬斯亮藍(lán)法測定（試驗(yàn)報(bào)告）考馬斯亮藍(lán)法測定蘋果組織微量可溶性蛋白含量

吳凡郭夢雨

摘要:本試驗(yàn)以蘋果果肉為研究對象，采取考馬斯亮藍(lán)比色法測定蛋白質(zhì)的吸光

度值，通過對果實(shí)可溶性蛋白提取緩沖液、緩沖液濃度、pH值、外源添加物對果肉可溶性蛋白提取效率的影響的研究，優(yōu)化蘋果果實(shí)可溶性蛋白含量測定方法，以期優(yōu)化果實(shí)可溶性蛋白測定條件，為客觀反映果實(shí)可溶性蛋白水平提供一種可行的方法。結(jié)果說明：外源添加PVP和EDTA以是蘋果可溶性蛋白提取率的主要影響因素。試驗(yàn)最終確定的提取條件為0.1mol/LpH9.0Tris-HCl提取緩沖液(內(nèi)含1mmol/LEDTA和1%PVP),此條件下蘋果果實(shí)可溶性蛋白的有效測定含量為34.93%。

（其中，1-11分別代表水、pH為7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-HCl緩沖溶液（100mmol/L））

不同緩沖體系對可溶性蛋白提取效果的影響尋常利用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定植物組織微量的可溶性蛋白時，常選用的提取液包括水、Tris-HCl緩沖液和磷酸（PBS）緩沖液。本試驗(yàn)研究了水以及不同pH值的Tris-HCl緩沖液定蘋果組織低量可溶性蛋白質(zhì)的提取影響。在Tris-HCl緩沖溶液（100mmol/L）有效緩

溶液及PH值水PH=7.2吸光度A蛋白含量μg蛋白含量%0.12919.1915.350.15123.2918.63PH=7.40.1823.1118.49PH=7.60.16325.5320.42PH=7.80.16626.0920.87PH=8.00.16024.9719.98PH=8.20.17227.2021.76PH=8.40.18629.8123.85PH=8.60.20132.6126.09PH=8.80.21835.7828.62PH=9.00.25843.2334.58沖范圍內(nèi)(7.0-9.2)選取如下pH值梯度：7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。采取1:5料液比制備可溶性蛋白質(zhì)提取液，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定提取液可溶性蛋白含量，測定結(jié)果如下圖。由圖可以看出：隨Tris-HCl緩沖溶液

pH值的升高，可溶性蛋白質(zhì)的提取效率增加；且Tris-HCl緩沖溶液提取效果明顯優(yōu)于水提組，其中pH7.2的Tris-HCl緩沖溶提取效率最低，但提取的可溶性蛋白含量依舊比水提組高17.55%；提取緩沖液pH值為9.0時提取效率最高，比水提組和提取組pH值為7.2分別高125.27%、85.61%。查閱文獻(xiàn)得，整體上Tris-HCl緩沖溶液提取效率高于磷酸鹽（PBS）緩沖溶液蘋果果肉組織可溶性蛋白質(zhì)提取的適合緩沖溶液為pH值為9.0的Tris-HCl緩沖溶液。

2.2.2不同緩沖液濃度對可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響

表四不同濃度Tris-HCl對可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響

溶液mmol/L吸光度A蛋白含量μg蛋白含量%

00.12919.1915.35100.14922.9218.34300.16626.0920.87500.19631.6825.34800.23839.5031.601000.26447.3337.86

（其中，1-6分別表示濃度為0、10、30、50、80、100mmol/L的pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液）

常用可溶性蛋白質(zhì)提取緩沖液濃度為0.02～0.05mol/L緩沖體系，試驗(yàn)過程

中，選擇0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mol/L的pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如下圖。由圖可知，低濃度pH為9.0的Tris-HCl緩沖條件即可明顯提高可溶性蛋白的提取效率(如10mmol/L緩沖溶液可溶性蛋白提取量比對照水提組高19.48%)。且隨著Tris-HCl緩沖液濃度增加，可溶性蛋白的提取效率增加。30、50、80、100mmol/L緩沖溶液可溶性蛋白提取量分別比對照高35.96%、65.08%、105.86%、146.64%。其中，100mmol/L緩沖液提取效果最正確，其可溶性蛋白有效提取量比80mmol/L緩沖液仍高出19.81%。

2.2.3外源添加物對可溶性蛋白提取效果的影響

以上述試驗(yàn)確定的100mmol/L，pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液為基礎(chǔ)提取液，添加蛋白酶保護(hù)劑和抑制劑，進(jìn)一步探討外源添加這些物質(zhì)對真實(shí)測定果蔬組織中可溶性蛋白質(zhì)的含量的影響。分別選取抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巰基乙醇、NaCl、MgCl2以及這些試劑的不同組合進(jìn)行試驗(yàn)，以不添加任何添加物的100mmol/L，pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液為對照，結(jié)果如下圖所示。

表五不同外源添加物對可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響

外源添加物抗壞半胱血酸氨酸EDTAPVPβ-巰基乙醇NaClMgCl2PVP＋β-巰基乙醇PVP＋EDTAEDTA＋PVP＋β-巰基乙醇無吸光度A蛋白含量μg蛋白含量%

0.2150.24335.2240.4328.1832.340.32655.9044.720.35461.1248.900.17327.3921.910.16325.5220.420.18028.6922.950.19130.7424.590.38366.5253.210.20132.6126.090.26143.4434.75

（其中，A-J分別代表抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巰基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巰基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巰基乙醇）

單獨(dú)添加2mmol/L半胱氨酸對可溶性蛋白提取效果無明顯影響；單獨(dú)添加2mmol/L抗壞血酸、0.15mmol/LNaCl、2%β-巰基乙醇和0.15mmol/LMgCl2對該濃度和pH值的緩沖液可溶性蛋白的提取效率均有抑制作用，這4種物質(zhì)處理后，可溶性蛋白提取量分別比對照組低23.31%、70.17%、58.60%、51.41%。從β-巰基乙醇和PVP及EDTA的復(fù)合處理結(jié)果也可看出其對果實(shí)可溶性蛋白提取的抑制作用，PVP＋β-巰基乙醇處理組可溶性蛋白測定量比PVP處理組低，PVP＋EDTA＋β-巰基乙醇處理組可溶性蛋白含量比PVP＋EDTA組低；單獨(dú)添加PVP和EDTA均有助于提高果實(shí)可溶性蛋白的提取率，PVP效果(比對照高40.71%)好于EDTA(比對照組高28.69%)。而PVP和EDTA復(fù)合處理效果比單獨(dú)處理效果更佳，其有效可溶性蛋白提取量比對照高53.12%。

2.3蘋果組織可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

表六蘋果組織可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

次數(shù)吸光度蛋白含量μ蛋白含平均值

123項(xiàng)目0.2600.2630.258g43.6044.1643.23量%34.8835.3334.5834.93上述研究結(jié)果說明，以考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定組織微量蛋白含量時，果實(shí)可溶性蛋白提取受提取液pH值、緩沖鹽種類、緩沖鹽濃度、外源添加物PVP和