hSTINGCTD蛋白的原核表達(dá)與純化

hSTINGCTD蛋白的原核表達(dá)與純化）摘要：免疫干擾素中的基因接頭刺激免疫蛋白(stimulatorofinterferongene,STING)是一種介于誘導(dǎo)胞內(nèi)基因DNA，并誘導(dǎo)固有細(xì)胞免疫病毒應(yīng)答的重要基因接頭刺激蛋白,在人類機(jī)體在對(duì)抗免疫病毒后的免疫代謝反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。具體而言就是宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別入侵病原體的DNA，將信號(hào)傳遞給STING，導(dǎo)致TANK連接激酶1和干擾素調(diào)控因子3磷酸化，從而促進(jìn)Ⅰ型IFN的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而抑制病毒復(fù)制。為進(jìn)一步研究該蛋白，本研究根據(jù)已報(bào)道STING蛋白的CTD結(jié)構(gòu)域,設(shè)計(jì)并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化后人工合成相應(yīng)的核酸序列，將其插入至pET-21b質(zhì)粒中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-21b-SUMO-hSTINGCTD-cut3質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)細(xì)胞。將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌液進(jìn)行SDS電泳鑒定，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示，在35kD處有一條明顯的蛋白條帶。研究結(jié)果表明,STING的截?cái)嗟鞍椎玫搅烁咝П磉_(dá)，為該蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：干擾素基因刺激蛋白(stimulatorofinterferongene，STING)；CTD結(jié)構(gòu)域；IPTG；原核表達(dá)；誘導(dǎo)hSTINGCTDProkaryoticExpressionandPurificationofProteinSummary:Interferongenestimulatingprotein(stimulatorofinterferongene,STING)isanimportantconnectorproteinthatmediatesintracellularDNAtoinduceinnateimmuneresponseandplaysakeyroleinantiviralimmuneresponse.Specifically,hostcellsrecognizeinvadingpathogensthroughpatternrecognitionreceptorsDNA,transmitsignalstoSTING,leadingtophosphorylationofTANKjunctionkinase1andinterferonregulatoryfactor3,thuspromotingup-regulationoftypeIIFNandinhibitingvirusreplication.Tofurtherstudytheprotein,accordingtotheCTDdomainofthereportedSTINGprotein,thecorrespondingnucleicacidsequencewasdesignedandsynthesizedaccordingtothecodonpreferenceofEscherichiacoli,insertedintothepET-21bplasmid,andthepET-21b-SUMO-ofprokaryoticexpressionvectorwasconstructedpET-21b-SUMO-hSTINGCTDplasmidsandtransfertoBL21(DE3)cells.TheIPTGinducedbacterialsolutionwasidentifiedbySDSelectrophoresisandtheinductionconditionswereoptimized.Theresultsshowedthattherewasanobviousproteinbandat35kD.Accordingtotheresults,thetruncatedproteinofSTINGwasexpressedefficiently,whichlaidafoundationforthestudyofitsfunction.Keywords:Interferongenestimulatingprotein(Stimulatorofinterferongene,STING);CTDdomain;IPTG;Prokaryoticexpression;Induction引言：干擾素基因刺激蛋白（STING）是一種跨膜蛋白，通常在152-173位區(qū)域（dimerizationdomain，DD），分子交接后會(huì)形成一個(gè)二聚體并始終處于自我發(fā)生抑制運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。通過(guò)抑制交接合成反應(yīng)可以形成兩個(gè)新的二聚體并同時(shí)作用處于自我抑制合成或者抑制交接反應(yīng)中的狀態(tài)。當(dāng)然它也會(huì)直接受到部分配體(比如說(shuō)CDN)的變化，并且對(duì)它影響很大。受到刺激后，激活后的每個(gè)肽和STING多肽分子通過(guò)二聚體多肽激酶一都能夠?qū)⒚總€(gè)存在細(xì)胞質(zhì)中的分子和其中的每個(gè)肽和TANK分子進(jìn)行結(jié)合并形成二聚肽激酶1（TANK-bindingkinase1，TBK1），介導(dǎo)TBK1對(duì)IRF3的磷酸化分子刺激后會(huì)使分子核的構(gòu)型發(fā)生變化并被分子激活,招募進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)過(guò)程中的TANK分子結(jié)合酶刺激酶1(TANK-bindingkinase1,TBK1)，激活后的每個(gè)肽和STING多肽分子通過(guò)二聚體多肽激酶一都能夠?qū)⒚總€(gè)存在細(xì)胞質(zhì)中的分子和其中的每個(gè)肽和TANK分子進(jìn)行結(jié)合并形成二聚肽激酶1,介導(dǎo)出了TBK1對(duì)于GIRF3的磷酸化，導(dǎo)致干擾素（interferon，IFN）-β和其它多種細(xì)胞素（cytokines）的形成。IFNβ的產(chǎn)生是STING活化的標(biāo)志。而腫瘤微環(huán)境（TME）天然免疫的信號(hào)傳導(dǎo)是腫瘤特異性T細(xì)胞的激活和腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL）浸潤(rùn)的關(guān)鍵步驟。其中I型IFN對(duì)腫瘤激活的T細(xì)胞活化起著關(guān)鍵作用。這樣，STING不僅可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素基因的表達(dá)，在天然免疫系統(tǒng)信號(hào)進(jìn)行通路中起著非常重要影響作用；STING激動(dòng)劑能激活主要包括樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫刺激導(dǎo)致細(xì)胞，改變中國(guó)腫瘤微環(huán)境并誘導(dǎo)了腫瘤組織特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生。天然免疫系統(tǒng)是人體抵抗病原入侵的第一道防線，來(lái)源于DNA病毒、細(xì)菌以及自身?yè)p傷細(xì)胞的DNA能夠被胞質(zhì)內(nèi)的DNA-sensingreceptor識(shí)別，激活宿主產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和其它免疫因子。目前已發(fā)現(xiàn)的DNA-sensingreceptor主要有TLR9、AIM2、cGAS等三個(gè)蛋白，其中TLR9定位在內(nèi)體小泡（endosomal）膜上并主要負(fù)責(zé)探測(cè)胞外的游離DNA，AIM2、cGAS則定位在細(xì)胞質(zhì)中并探測(cè)胞內(nèi)的DNA。在上述三個(gè)DNA-sensingreceptorc中，cGAS的功能最為重要。cGAS在識(shí)別雙鏈DNA之后可以激活下游STING（stimulatorofinterferongenes）蛋白，激活的STING構(gòu)象發(fā)生改變并進(jìn)一步激活下游的TBK1以及轉(zhuǎn)錄因子IRF3，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素。小分子化合物2'3'-cGAMP是連接cGAS與STING的第二信使。2013年，德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的ZhijianJChen教授研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)不同類型DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞漿提取物進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)cGAS在DNA作用下能夠催化合成內(nèi)源性分子2'3'-cGAMP，而2'3'-cGAMP可以與STING蛋白直接結(jié)合并通過(guò)二聚體構(gòu)象的改變來(lái)激活STING蛋白。STING蛋白是Ⅰ型IFN生成過(guò)程中的中心蛋白，它主要在免疫相關(guān)的胸腺、心、脾、胎盤、肺及外周血白細(xì)胞等組織細(xì)胞中高表達(dá)，在細(xì)胞中通常以二聚體的形式存在。聚合后的STING蛋白處于非激活狀態(tài)，當(dāng)受到諸如cGAMP、cdi-GMP等環(huán)狀核苷酸分子的刺激后由于構(gòu)型發(fā)生變化而被激活。激活后的STING二聚體能招募TBK1蛋白至自身CTD結(jié)構(gòu)域上，并介導(dǎo)TBK1對(duì)IRF3的磷酸化過(guò)程。靜息狀態(tài)下的STING蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，激動(dòng)狀態(tài)下的STING蛋白將伴隨著招募來(lái)的TBK、IRF3等一起滑向靠近細(xì)胞核的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部位。被磷酸化修飾的IRF3在此過(guò)程中發(fā)生聚合形成二聚體，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)而促進(jìn)IFN的轉(zhuǎn)錄。除了IRF3外，STING蛋白還能通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)下游TNF、IL-6等免疫因子的合成。STING堪稱“中國(guó)蛋白”之一，是于2008年至2009年間由世界上好幾個(gè)科研小組（包括北京大學(xué)的蔣爭(zhēng)凡教授研究組，稱其為ERIS；以及武漢大學(xué)舒紅兵院士研究組，稱其為MITA）幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)的在先天免疫通路中起重要聯(lián)接及感應(yīng)功能的接頭蛋白。STING是一個(gè)多次跨膜蛋白，進(jìn)一步的研究表明，它可以直接感受和結(jié)合一類細(xì)菌特異的第二信使信號(hào)分子，如c-di-GMP，介導(dǎo)下游信號(hào)通路的激活，這反過(guò)來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他先天免疫反應(yīng)，這是固有免疫中的一個(gè)全新概念。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，我們發(fā)現(xiàn)先前預(yù)測(cè)的在不同物種中非常保守的第五個(gè)跨膜區(qū)實(shí)際上處于胞內(nèi)，并且這個(gè)區(qū)域?qū)τ赟TING形成同源二聚化介導(dǎo)生物學(xué)功能至關(guān)重要，這個(gè)結(jié)果與蔣爭(zhēng)凡研究組以前的發(fā)現(xiàn)非常吻合；結(jié)合與c-di-GMP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析，蘇曉東研究組提出，STING具有一個(gè)“蓋子”（lid）區(qū)域，在沒(méi)有結(jié)合c-di-GMP前，這個(gè)區(qū)域具有較高柔性，易于敞開(kāi)；一旦感應(yīng)及結(jié)合c-di-GMP后，這個(gè)“蓋子”區(qū)域就會(huì)與其它部分一起形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，非常牢固的結(jié)合c-di-GMP，復(fù)合物也進(jìn)一步穩(wěn)定了同源二聚體結(jié)構(gòu)。STING是DNA信號(hào)通路的重要接頭蛋白。早期利用細(xì)菌信號(hào)分子環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(cyclicdiguan-ylate,c-di-GMP)刺激巨噬細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，STING能通過(guò)其CTD直接結(jié)合c-di-GMP，2個(gè)STING可以結(jié)合1個(gè)c-di-GMP分子，因此推測(cè)STING可能是一個(gè)胞內(nèi)的細(xì)菌識(shí)別分子。但競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STING不能結(jié)合胞內(nèi)其他形式的DNA和RNA，表明STING可能只是體內(nèi)環(huán)二核苷酸的特異性識(shí)別分子。之后越來(lái)越多的研究表明，STING上游存在識(shí)別核酸的感受器，而STING作為接頭蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，多種DNA的感受器都有可能依賴STING而發(fā)揮作用，包括DAI、RNA聚合酶Ⅲ、DDX41、DNA-PK、MRE11、SOX2及IFI16等。作為固有免疫應(yīng)答中的接頭蛋白，STING在介導(dǎo)Ⅰ型IFN中的重要性已基本得到確認(rèn)。越來(lái)越多的臨床研究成果表明,STING細(xì)胞信號(hào)抑制通路在人體調(diào)控多種DNA病毒的免疫復(fù)制中可以發(fā)揮重要抑制作用,包括腺病毒、牛痘細(xì)胞病毒和多種乳頭狀腫瘤細(xì)胞病毒。STING這個(gè)信號(hào)連接通路也在防止逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV的感染時(shí)可以發(fā)揮作用。有一項(xiàng)研究結(jié)果表明,反轉(zhuǎn)錄病毒中的RNA－DNA雜合體細(xì)胞可以同時(shí)激活一個(gè)STING分子通路,這可以說(shuō)明廣泛的脫氧核酸分子結(jié)構(gòu)均衡體具備同時(shí)激活一個(gè)STING的通路能力。綜上所述，通過(guò)對(duì)STING及其與c-di-GMP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析，非常清楚地展示了STING感受和結(jié)合c-di-GMP的分子機(jī)制，為進(jìn)一步的免疫治療及c-di-GMP作為疫苗佐劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了非常重要的線索。1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間本實(shí)驗(yàn)于2021年1月10日至2021年4月8日期間，歷時(shí)3個(gè)月，在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍子湖校區(qū)第一實(shí)驗(yàn)樓412實(shí)驗(yàn)室完成。1.2實(shí)驗(yàn)材料1.2.1菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞、試劑本次實(shí)驗(yàn)使用的E.coliTOP10、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、插入融合標(biāo)簽?zāi)康幕虮磉_(dá)載體pET21b-His6-SUMO均為本實(shí)驗(yàn)室保存。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式小提DNA質(zhì)粒試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)MarkerDL2000、DL5000購(gòu)自TaKaRa公司。2×SDS上樣緩沖液購(gòu)自河南鄭州鼎國(guó)生物科技有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。YeastExtract酵母粉、Tryptone蛋白胨粉購(gòu)自ThermoFisherScientificInc。PremixTaq?購(gòu)自TakaraBioInc。Ni-NTAAgarose(Qiagen)購(gòu)自河南天馳生物科技有限公司。1.3主要儀器設(shè)備臺(tái)式恒溫離心機(jī)（Eppendorf）；溫度梯度PCR儀（Eppendorf）；電泳儀、電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；超純水系統(tǒng)（申貝科學(xué)儀器（蘇州）有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（SANYOElectricCo.,Ltd.）。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1pET-21b-SUMO-hSTINGCTD-cut3表達(dá)質(zhì)粒的合成pET-21b-SUMO-hSTINGCTD-cut3質(zhì)粒由金唯智生物科技有限公司（蘇州）進(jìn)行合成構(gòu)建，宿主菌為E.coliDH5α。1.4.2hSTINGCTD-cut3蛋白誘導(dǎo)表達(dá)——IPTG濃度條件優(yōu)化將pET-21b-SUMO-hSTINGCTD-cut3分別被轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，將其菌液涂布在濃度為100μg/mL氨芐抗性LB固體培養(yǎng)基上后放置于溫度37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行12~16小時(shí)的培養(yǎng)。將濃度為100μg/mL氨芐抗性固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落接種到10mL含有濃度為100μg/mL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，并放置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行12~16小時(shí)的培養(yǎng)。之后，以1:100的比例將菌液接種到加有100μg/mLAmp濃度的100mLLB培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃，轉(zhuǎn)速為220r/min的振蕩培養(yǎng)，并時(shí)刻進(jìn)行取樣并測(cè)量菌液的OD值，當(dāng)菌液擴(kuò)增至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)，即菌液OD600到達(dá)0.6~0.8之間時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)，并添加IPTG誘導(dǎo)劑以誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。并試驗(yàn)在以添加不同濃度的IPTG誘導(dǎo)劑，不同誘導(dǎo)溫度，不同誘導(dǎo)時(shí)間三種變量條件之間進(jìn)行優(yōu)化組合，并得出結(jié)論在添加0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度為18℃，轉(zhuǎn)速為140r/min，誘導(dǎo)時(shí)間為12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)表達(dá)的效率最高，同時(shí)取誘導(dǎo)前菌液1mL作為誘導(dǎo)前對(duì)照組，并將菌液以4℃，8000rpm，10min離心后棄上清，加入100μLPBS緩沖液重懸混勻，后加入等體積的2×SDS上樣緩沖液（SDSSampleLoadingBuffer）并振蕩離心混合均勻，后置于孵育器上，設(shè)置孵育溫度99℃，10min變性。誘導(dǎo)結(jié)束之后，取1mL菌液到EP管中作為誘導(dǎo)后對(duì)照組，在4℃離心以8000rpm，10min離心后棄上清，并加100μLPBS緩沖液重懸混合均勻，之后加同體積2×SDS上樣緩沖液并振蕩離心混合均勻，后置于孵育器上，設(shè)置孵育溫度99℃，10min變性。對(duì)剩余菌液進(jìn)行溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為8000rpm離心10min，后棄掉上清，加入10mLBindingBuffer重懸，充分混勻后與冰上在功率設(shè)置為20%，工作頻率設(shè)置為工作5s間隔10s，120次超聲波的超聲波細(xì)胞破碎機(jī)中進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎，破碎完成后可以觀察到菌液由渾濁變澄清透明即表明該蛋白的可溶性較好。破碎后使用低溫離心機(jī)進(jìn)行4℃，12000rpm，30min離心，之后收集破碎后蛋白上清和沉淀，各取20μL加入提前加好20μL2×SDS上樣緩沖液的1.5mL離心管中，之后放入孵育器中設(shè)置溫度99℃，10min進(jìn)行高溫孵育讓蛋白質(zhì)變性，之后進(jìn)行SDS凝膠電泳，以分析表達(dá)效率。1.4.3SDS凝膠電泳（1）常規(guī)試劑的配制1.30%聚丙烯酰胺貯液：丙烯酰胺150g，甲叉雙丙烯酰胺4g，雙蒸水500ml，濾紙過(guò)濾后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH8.8Tris-HCl分離膠緩沖液：18.15gTris，用1mol/LHCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3.1.0mol/L，pH6.8Tris-HCl分離膠緩沖液：12gTris，用1mol/L調(diào)pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4.10%SDS溶液：10gSDS加水定容至100ml，完全溶解室溫保存；5.10%AP溶液：0.1gAP（過(guò)硫酸銨）加水定容至1ml，用前新鮮配制；6.1×SDS電泳緩沖液：25mMTris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS（1g/L），pH8.30；7.染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，過(guò)濾除去雜質(zhì)；8.脫色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9.固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10.2×SDS上樣緩沖液：10%SDS0.4ml，0.375MTris-HCl（pH6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1%溴酚蘭10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分裝后-20℃保存。（2）樣品的處理1.蛋白含量較低的酶制劑或原料樣品①粉劑（或顆粒）樣品稱取樣品1g，加入3-5ml蒸餾水進(jìn)行攪拌溶解1h（攪拌時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行增減），4000rpm離心10min，取離心上清液等體積加入20%的三氯乙酸聚沉30min，離心，棄去離心上清液，用70%的丙酮溶液洗滌沉淀，4000rpm離心10min，重復(fù)洗滌3-5次，將丙酮洗滌液吹干，加入適量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于電泳實(shí)驗(yàn)。②液體樣品液體樣品經(jīng)離心后，取離心上清液等體積加入20%的三氯乙酸聚沉30min，離心，棄去離心上清液，用70%的丙酮溶液洗滌沉淀，4000rpm離心10min，重復(fù)洗滌3-5次，將丙酮洗滌液吹干，加入適量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于電泳實(shí)驗(yàn)。2.蛋白含量相對(duì)較高的酶制劑或原料樣品①粉劑（或顆粒）樣品稱取樣品1g，加入3-5ml蒸餾水進(jìn)行攪拌溶解1h（攪拌時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行增減），4000rpm離心10min，取離心上清液用于電泳實(shí)驗(yàn)。②液體樣品液體樣品經(jīng)離心后，取離心上清液用于電泳實(shí)驗(yàn)。3.未知樣品對(duì)未知樣品可以進(jìn)行分析歸類（是否為酶制劑，是哪一類酶），根據(jù)已知電泳圖譜研究確定該類物質(zhì)能跑出清晰電泳條帶的蛋白濃度影響范圍，在對(duì)未知樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)前，測(cè)定其蛋白含量，根據(jù)其結(jié)果然后進(jìn)行選擇適當(dāng)提高處理。（3）凝膠的配制1..設(shè)備檢漏應(yīng)將安裝電泳板和玻璃板配件按規(guī)定順序地安裝好并擰緊固定,在安裝電泳板與玻璃板間隙處注滿少量蒸餾水,靜置15-20min,觀察是否有液體浸透而出,若無(wú)則進(jìn)行下一步操作,反之,則需要拆除零件進(jìn)行一次重新安裝,并進(jìn)行重復(fù)多次檢漏至已無(wú)任何液體浸透而出。注意：如果樣品數(shù)量較少，一個(gè)膠板就足夠了，此時(shí)應(yīng)在另一面使用膠片分離器，以防止涂膠時(shí)出現(xiàn)短路。2.分離膠的制備根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，不同濃度的SDS分離膠的最佳分離范圍如下表蛋白質(zhì)分子量范圍（KD）適宜的凝膠濃度（％）＞100830～1001010～3012＜1015將檢漏的蒸餾水倒出，按下表進(jìn)行SDS分離膠的配制（使用凝膠試劑盒）電泳凝膠濃度試劑8％10％12％15％H2O（ml）4.634.03.32.330％Acr－Bis（29：1）（ml）2.673.34.05.01.5mol／LTris.cl（pH8.8）（ml）2.510％SDS（ml）0.110％AP（ml）0.1TEMED（μl）4444總體積（ml）10注：如室溫高于30℃，可適量減少TEMED30-50%，防止膠過(guò)快凝結(jié)；如室溫低于20℃，可適量增加TEMED30-50%，防止膠過(guò)慢凝結(jié)。常用的分離膠濃度為10%。根據(jù)以上表格準(zhǔn)備，所有試劑進(jìn)入燒杯，充分混合，快速注射，注射過(guò)程要平穩(wěn)，避免氣泡的產(chǎn)生，注膠后用蒸餾水水封(水封的目的是使分離膠變平，消除氣泡，防止氧化)，按照上表步驟進(jìn)行材料配制,所有注膠試劑均勻加入到燒杯中,充分?jǐn)嚢杌靹蚝?迅速開(kāi)始進(jìn)行材料注膠,注膠操作過(guò)程要平穩(wěn),避免產(chǎn)生較大氣泡,注膠過(guò)程完成后用少量蒸餾水迅速進(jìn)行水封(這種水封的設(shè)計(jì)目的主要是為了使分離膠變平,并排除任何氣泡,且可以防止氧化),凝膠聚合好的重要標(biāo)志也就是在凝膠與水層之間可以形成清晰的界面3.濃縮膠的制備分離膠制備完成后，靜置60-90min，確保分離膠凝結(jié)完全后，倒出水封液體并用濾紙把剩余的水分吸干，按下表進(jìn)行SDS濃縮膠的配制。試劑濃度（％）H2O（ml）4230％Acr－Bis（29：1）（ml）10.51.0mol／LTris.cl（pH8.8）（ml）10.510％SDS（μl）804010％AP（μl）6030TEMED（μl）84總體積（ml）63所有試劑加入燒杯中，充分混勻后，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入樣梳（樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平），靜置40-60min。4.制樣吸取經(jīng)預(yù)處理后樣品25μl與25μl上樣緩沖液混合均勻后，于沸水煮3-5min去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合，冷卻后4000rpm離心4min。5.上樣濃縮后的膠液凝結(jié)后,向上加樣槽內(nèi)每孔倒入適量電泳緩沖液,拔出樣梳(要使帶有鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部隨樣排出,否則會(huì)嚴(yán)重影響加樣時(shí)的效果),向每孔內(nèi)加樣10μl（加樣時(shí)移液槍要始終保持豎直，且加樣迅速，為避免出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，最好方法選取中部孔注樣）。6.跑膠加樣完成后，在電泳槽內(nèi)加入適量電泳緩沖液，連接好冷凝水，接通電源，進(jìn)行電泳，穩(wěn)壓90V，電泳90min左右，進(jìn)入分離膠后，電壓改為120V，待溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。7.凝膠板剝離與固定電泳結(jié)束后，取開(kāi)玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)（剝膠時(shí)要小心，將凝膠保持完好），用蒸餾水小心清洗1-3次，加入固定液進(jìn)行固定40-60min，倒出固定液，蒸餾水清洗3-5次。8.染色固定清洗結(jié)束后，倒入染色液，染色40-60min。9.脫色染色結(jié)束后，蒸餾水清洗3-5次，倒入脫色液進(jìn)行脫色，30-60min后更換1次脫色液后，脫色至蛋白條帶清晰即可。10.清洗電泳過(guò)程結(jié)束后,將用于電泳隔熱玻璃的模版及熱水燒杯仔細(xì)進(jìn)行清洗,并用少量蒸餾水對(duì)其進(jìn)行一次漂洗后,將進(jìn)行電泳所用所有物品全部歸置原位。1.4.4表達(dá)產(chǎn)物的純化為了提高目標(biāo)蛋白的純度，采用鎳離子親和柱對(duì)異源蛋白進(jìn)行梯度洗脫。首先向柱中加配制好的氯化鎳，再加5倍體積的bindingbuffer平衡柱體后將上清加入到預(yù)處理過(guò)的Ni-NTA進(jìn)行上樣，溫度保持在4℃，并在轉(zhuǎn)速160r/min的搖床上結(jié)合3小時(shí)。結(jié)合之后將柱中初濾液放入15mL管中留樣，隨后分別用10mL咪唑濃度為10，20，50，100，250，500mMElutionBuffer進(jìn)行梯度洗脫并且分別用15mL的離心管取樣保存。取蛋白樣品各20μL加入20μL的SDS蛋白上樣緩沖液在孵育器中，99℃孵育10min。處理后的樣品使用配制好的10%濃度的SDS分離膠進(jìn)行電泳。隨后我們使用超濾管對(duì)目的蛋白樣品重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析多次超濾離心處理，以進(jìn)一步發(fā)展提高自身蛋白純度要求以及洗去樣品中含有的咪唑。后將得到的目的蛋白保存在含有100mM，pH8.0Tris-HCl，10%蔗糖的保存液中，置于-70℃環(huán)境下長(zhǎng)期貯存。2.結(jié)果與分析在對(duì)STING－CUT3進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白進(jìn)行SDS凝膠電泳的結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后在51kDa處都有目的條帶出現(xiàn)，與理論大小相一致。圖1.STING－CUT3蛋白誘導(dǎo)劑濃度摸索樣品依次為：未誘導(dǎo)、0.1、0.3、0.6、0.9、1mmol／L圖2.STING－CUT3蛋白誘導(dǎo)劑溫度摸索樣品依次為：未誘導(dǎo)、16、18、20、25、37℃圖3.STING－CUT3蛋白誘導(dǎo)劑時(shí)間摸索樣品依次為：未誘導(dǎo)、6、8、10、12、20h3.討論STING蛋白在免疫系統(tǒng)中起著相當(dāng)重要的作用，尤其是在監(jiān)測(cè)和清除人體產(chǎn)生的癌細(xì)胞的功能中。沒(méi)有它的參與，這個(gè)功能就像無(wú)源之水，無(wú)根之木。如今，惡性腫瘤是醫(yī)學(xué)界努力攻克的堡壘之一，因此刺蛋白越來(lái)越受到科學(xué)家的關(guān)注和青睞?？茖W(xué)家們一直在尋找可以利用自身免疫系統(tǒng)對(duì)抗癌癥的新方法，并試圖回答這樣對(duì)于一個(gè)重要問(wèn)題:我們能訓(xùn)練免疫系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別并標(biāo)記癌細(xì)胞進(jìn)而對(duì)它們之間進(jìn)行環(huán)境破壞嗎？一種被稱為STING的蛋白引起了科學(xué)家們的興趣。當(dāng)激活STING時(shí)，它會(huì)觸發(fā)身體釋放一部分能夠識(shí)別和破壞癌細(xì)胞的T細(xì)胞。但是如何將其激活呢？在一項(xiàng)題為“DesignofamidobenzimidazoleSTINGreceptoragonistswithsystemicactivity”的文章中，科學(xué)家描述了他們尋找新分子來(lái)激活STING的工作。該項(xiàng)研究的主要作者JoshiRamanjulu說(shuō)：“這是一個(gè)困難的尋找過(guò)程。多年來(lái)，我們一直在研究STING，以進(jìn)一步了解它是如何工作以及它在細(xì)胞中的作用。通過(guò)篩選多個(gè)分子文庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)了一系列有希望的活性分子，通過(guò)調(diào)整它們的性質(zhì)，使它們成為更有效的STING蛋白激動(dòng)劑?！边@些分子是同類中的第一種，其作用不同于正在開(kāi)發(fā)的其他一些STING激動(dòng)劑。Joshi解釋說(shuō):“這些新分子的潛在優(yōu)勢(shì)之一是，它們可以被注射到血液中，而不是直接注射到腫瘤中，這有可能達(dá)到難以觸及的實(shí)體腫瘤和從主要腫瘤中分離出來(lái)的癌細(xì)胞簇，從而擴(kuò)大了患者的治療選擇。我們還在小鼠癌癥研究模型中看到，新分子激活了免疫分析系統(tǒng)的‘記憶’，也就是說(shuō)，如果癌癥復(fù)發(fā)，免疫組織細(xì)胞就已經(jīng)發(fā)展做好立刻攻擊準(zhǔn)備，而無(wú)需提供更多治療?！盨TING蛋白是Ⅰ型IFN生成過(guò)程中的中心蛋白，它主要在免疫相關(guān)的胸腺、心、脾、胎盤、肺及外周血白細(xì)胞等組織細(xì)胞中高表達(dá)，在細(xì)胞中通常以二聚體的形式存在。聚合后的STING蛋白處于非激活狀態(tài)，當(dāng)受到諸如cGAMP、cdi-GMP等環(huán)狀核苷酸分子的刺激后由于構(gòu)型發(fā)生變化而被激活。激活后的STING二聚體能招募TBK1蛋白至自身CTD結(jié)構(gòu)域上，并介導(dǎo)TBK1對(duì)IRF3的磷酸化過(guò)程。靜息狀態(tài)下的STING蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，激動(dòng)狀態(tài)下的STING蛋白將伴隨著招募來(lái)的TBK、IRF3等一起滑向靠近細(xì)胞核的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部位。被磷酸化修飾的IRF3在此過(guò)程中發(fā)生聚合形成二聚體，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)而促進(jìn)IFN的轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)人們對(duì)cGAS-STING通路的認(rèn)識(shí)不斷深刻。其對(duì)腫瘤的作用也從最初促進(jìn)腫瘤免疫產(chǎn)生IFN-ⅰ，加深到增加癌細(xì)胞衰老表型的表達(dá)，促進(jìn)其衰老和凋亡。其中最經(jīng)典為cGAS-STING-TBK1-IRF3-Ⅰ型干擾素通路：STING可能誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生并進(jìn)一步激活抗腫瘤CD8+T細(xì)胞。目前，刺激性抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)已取得較大進(jìn)展，已有多個(gè)藥物進(jìn)入臨床研究。包括ImmuneSensorTherapeutics公司旗下的IMSA-101，葛蘭素史克旗下的GSK3745417，百時(shí)美施貴寶公司旗下的BMS-986301，SpringBankPharmaceuticals公司旗下的SB-11285，默沙東公司旗下的MK-1454。在適應(yīng)癥方面，目前主要是針對(duì)實(shí)體瘤，但也已經(jīng)開(kāi)始向非實(shí)體瘤開(kāi)發(fā)，例如MK-1454就針對(duì)淋巴瘤在進(jìn)行開(kāi)發(fā)。cGAS-STING信號(hào)通路作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重要的免疫應(yīng)答通路，是構(gòu)成固有免疫的重要部分。cGAS作為一種模式識(shí)別受體，識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞DNA，可通過(guò)cGAS-STING-TBK1-IRF3-IFN軸或STAT信號(hào)通路產(chǎn)生Ⅰ型IFN、產(chǎn)生炎性小體等方式參與腫瘤免疫，減小腫瘤體積。總而言之，STING信號(hào)通路是目前的研發(fā)明星分子，目前國(guó)內(nèi)外介入STING激動(dòng)劑研究的越來(lái)越多，得益于此，STING激動(dòng)劑不斷涌現(xiàn)的、在各大疾病治療領(lǐng)域取得了很大的進(jìn)展。特別是在腫瘤細(xì)胞免疫系統(tǒng)治療技術(shù)領(lǐng)域，吸引了包括默沙東、百時(shí)美施貴寶等諸多制藥企業(yè)巨頭的目光，多個(gè)藥物進(jìn)入了一個(gè)臨床應(yīng)用研究。另外,與腫瘤放療、化療、腫瘤疫苗、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、CAR－T等干細(xì)胞免疫治療或者其他新型的腫瘤治療藥物方式可以聯(lián)合開(kāi)發(fā)應(yīng)用,不僅因?yàn)榭梢杂行p少這些STING激動(dòng)劑的合理用量和減少毒副作用,還可以通過(guò)不同免疫機(jī)制間的協(xié)同作用增強(qiáng)它的抗惡性腫瘤治療效果、克服其對(duì)腫瘤疫苗治療的藥物耐受性,取得最佳的腫瘤治療和療程和效果。相信未來(lái)隨著科學(xué)研究的不斷深入,進(jìn)展速度會(huì)越來(lái)越快。參考文獻(xiàn)[1]熊思東.抗病毒感染的固有免疫機(jī)制[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2011，31(3)：179-180.[2]IshikawaH，BarberGN.STINGisanendoplasmicreticulumadaptorthatfacilitatesinnateimmunesignalling[J].Nature，2008，455(7213)：674-678.[3]ZhongB，YangY，LiS，etal.TheadaptorproteinMITAlinksvirus-sensingreceptorstoIRF3transcriptionfactoractivation[J].Immunity，2008，29(4)：538-550.[4]JinL，WatermanPM，JonscherKR，etal.MPYS，anovelmembranetetraspanner，isassociatedwithmajorhistocompatibilitycomplexclassⅡandmediatestransductionofapoptoticsignals[J].MolCellBiol，2008，28(16)：5014-5026.[5]SunW，LiY，ChenL，etal.ERIS，anendoplasmicreticulumIFNstimulator，activatesinnateimmunesignalingthroughdimerization[J].ProcNatlAcadSciUSA，2009，106(21)：8653-8658.[6]OuyangS，SongX，WangY，etal.StructuralanalysisoftheSTINGadaptorproteinrevealsahydrophobicdimerinterfaceandmodeofcyclicdi-GMPbinding[J].Immunity，2012，36(6)：1073-1086.[7]GaoP，AscanoM，ZillingerT，etal.Structure-functionanalysisofSTINGactivationbyc[G(2'，5')pA(3'，5')p]andtargetingbyantiviralDMXAA[J].Cell，2013，154(4)：748-762.[8]TanakaY，ChenZJ.STINGspecifiesIRF3phosphorylationbyTBK1inthecytosolicDNAsignalingpathway[J].SciSignal，2012，5(214)：ra20.[9]ZhongB，ZhangL，LeiC，etal.TheubiquitinligaseRNF5regulatesantiviralresponsesbymediatingdegradationoftheadaptorproteinMITA[J].Immunity，2009，30(3)：397-407.[10]BhatN，F(xiàn)itzgeraldKA.RecognitionofcytosolicDNAbycGASandotherSTING-dependentsensors：Highlights[J].EurJImmunol，2014，44(3)：634-640.[11]TsuchidaT，ZouJ，SaitohT，etal.TheubiquitinligaseTRIM56regulatesinnateimmuneresponsestointracellulardouble-strandedDNA[J].Immunity，2010，33(5)：765-776.[12]CuiH，LiuY，HuangY.RolesofTRIM32incornealepithelialcellsafterinfectionwithherpessimplexvirus[J].IntJExpCellPhysiolBiochemPharmacol，2017，43(2)：801-811.[13]SunL，WuJ，DuF，etal.CyclicGMP-AMPsynthaseisacytosolicDNAsensorthatactivatesthetypeⅠinterferonpathway[J].Science，2013，339(6121)：786-791.[14]ZhangX，ShiH，WuJ，etal.CyclicGMP-AMPcontainingmixedphosphodiesterlinkagesisanendogenoushigh-affinityligandforSTING[J].MolCell，2013，51(2)：226-235.[15]QiuH，F(xiàn)anY，JoyeeAG，etal.TypeⅠIFNsenhancesusceptibilitytochlamydiamuridarumlunginfectionbyenhancingapoptosisoflocalmacrophages[J].JImmunol，2008，181(3)：2092-2102.[16]BarkerJR，KoestlerBJ，CarpenterVK，etal.STING-dependentrecognitionofcyclicdi-AMPmediatestypeⅠinterferonresponsesduringchlamydiatrachomatisinfection[J].MBio，2013，4(3)：e00018-13.[17]KimS，LiL，MaligaZ，etal.Anticancerflavonoidsaremouse-selectiveSTINGagonists[J].ACSChemBiol，2013，8(7)：1396-1401.[18]ZhangH，HanMJ，TaoJ，etal.RatandhumanSTINGsprofilesimilarlytowardsanticancer/antiviralcompounds[J].SciRep，2015，5：18035.[19]CorralesL，GlickmanLH，McwhirterSM，etal.DirectactivationofSTINGinthetumormicroenvironmentleadstopotentandsystemictumorregressionandimmunity[J].CellRep，2015，11(7)：1018-1030.[20]KapustRB,TozserJ,TDCopeland,DSWaugh,etal.TheP1’specificityoftobaccoetchvirusprotease[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2002,294(5):949–955.[21]NallamsettyS,KapustRB,TozserJ,CherryS.Efficientsite-specificprocessingoffusionproteinsbytobaccoveinmottlingvirusproteaseinvivoandinvitro[J].ProteinExpressionandPurification,2004,38(1):108-115.[22]KapustRB,WaughDS.ControlledintracellularprocessingoffusionproteinsbyTEVprotease[J].ProteinExpressionandPurification,2000,19(2):312–8.[23]KapustRB,T?zsérJ,FoxJD,AndersonDE,CherryS,CopelandTD,WaughDS.Tobaccoetchvirusprotease:mechanismofautolysisandrationaldesignofstablemutantswithwild-typecatalyticproficiency[J].ProteinEngineering,DesignandSelection,2001,14(12):993–1000.[24]SVDBerg,PALofdahl,THard,HBerglund.ImprovedsolubilityofTEVproteasebydirectedevolution[J].JournalofBiotechnology,2006,121(3):291–298.[25]FangL,JiaKZ,TangYL,MaDY,YuM,HuaZC.Animprovedstrategyforhigh-levelproductionofTEVproteaseinEscherichiacolianditspurificationandcharacterization[J].ProteinExpressionandPurification,2007,51(1):102-9.[26]P.G.Blommel,B.G.Fox.Acombinedapproachtoimprovinglarge-scaleproductionoftobaccoetchvirusprotease[J].ProteinExpressionandPuri?cation,2007,55(1):53–68.[27]WuX,WuD,LuZ,ChenW,HuX,DingY.Anovelmethodforhigh-levelproductionofTEVproteasebySuperfolderGFPtag[J].Journalofbiomedicalandbiotechnology,2009,2009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