一氧化氮神奇生物化學(xué)作用正在揭示中

一氧化氮神奇生物化學(xué)作用正在揭示中吳國慶北京師范大學(xué)化學(xué)系 ９５年夏天在北京舉行的第２７屆國際化學(xué)奧林匹克有一道以ＮＯ的生物化學(xué)功能為主題的競賽試題、反映了試題編制者們力求的先進性、趣味性和新穎性，受到廣泛歡迎。下面是有關(guān)這個曾被美國某雜志選為明星分子的小小無機分子神奇功能的一些新近報道的綜述，讀者通過閱讀本文也許還可以感受到，化學(xué)對生命的研究已經(jīng)進步到什么地步。本文主要是根據(jù)ＣＥＮ，ＭＡＹ６、１９９６：３８～４２上一長篇報道改寫的。 你也許知道有一種叫做硝酸甘油酯的藥物，已經(jīng)用了１００多年了，它可以用來治療突發(fā)的心絞痛。其實，這是利用了這種藥物在生理條件下釋放出的一氧化氮，它或許是一氧化氮作為藥物的最老應(yīng)用，盡管是不自覺的，只是到了近年，人們才認(rèn)識到一氧化氮對動物有著多種重要作用。例如，已經(jīng)知道，它是神經(jīng)脈沖的傳遞介質(zhì)，有調(diào)節(jié)血壓的作用，能引發(fā)免癌功能等；如果人體不能及時制造出足夠的一氧化氮，會導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的疾?。焊哐獕?、血凝失常、免疫功能損傷、神經(jīng)化學(xué)失衡、性功能障礙以及精神痛苦等等；使用釋放ＮＯ的新藥甚至可能對抑制癌癥有重要作用。對一氧化氮的認(rèn)識首先要歸功于微量分析技術(shù)的發(fā)展，因為一氧化氮在生命體內(nèi)的濃度是極低的，僅達微摩爾級甚至更低。而且、一氧化氮在細(xì)胞間存留的壽命也很短，因為ＮＯ是單電子分子，很活潑，一旦生成,很快被反應(yīng)掉。因此，測試太難，這就不難理解，這樣簡單的分子為什么這樣晚才被人有所認(rèn)識。ＮＯ的生成一氧化氮分子在生命體中是在一氮化氮合成酶（下文用縮寫ＮＯＳ）的催化作用下生成的。這種酶有多種存在形式，但其功能都是氧化精氨酸的兩個胍基氮之一生成瓜氨酸和一氧化氮。反應(yīng)所需的電子來自輔酶=2\*ROMANII[即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰＨ）］,后者同時被氧化。分子態(tài)氧是一氧化氮的氧源。ＮＯ在生物體里的主要反應(yīng)在生物體內(nèi)ＮＯ的攻擊目標(biāo)首先是蛋白質(zhì)輔基里的金屬離子，特別是血紅蛋白里的鐵，它與金屬原子形成亞硝酰加合物。第二個去處是ＮＯ能與超氧離子（Ｏ２－）反應(yīng)生成過氧亞硝酸根（ＯＮＯＯ－），第三個去處是，跟蛋白質(zhì)或肽里的硫醇基反應(yīng)生成Ｓ－亞硝酰加合物。ＮＯ對ＮＯＳ的自抑制作用９６年３月在美國的一次全國會議上，有人描述了通過神經(jīng)原的ＮＯＳ的作用產(chǎn)生的一氧化氮如何快速地與酶本身的血紅素中心的亞鐵離子生成絡(luò)合吻的過程。該絡(luò)合物生成的速度極快，在酶合成第３個一氧化氮分子之前就使反應(yīng)達到平衡。據(jù)報道，與ＮＯ分子快速反應(yīng)的其他生物分子對該絡(luò)合反應(yīng)的速率沒有影響，這證明，ＮＯ脫離酶的活性中心與其他分子反應(yīng)前一直是鍵合著的。一旦生成亞鐵－亞硝酰絡(luò)合物，酶便不再具有活性。研究者使用可見光譜和拉曼光譜證實。甚至ＮＯ正在繼續(xù)合成時，７０～９０％的酶已經(jīng)失去活性成為自抑態(tài)。研究者很驚奇：為什么酶會如此快地因自己的產(chǎn)物（ＮO）而失活？他們認(rèn)為，可能酶的活性是組織中存在的氧量調(diào)節(jié)的。ＮＯ絡(luò)合物的生成容許神經(jīng)原的ＮＯＳ去合成ＮＯ，其速度則與氧的濃度成正比。ＮＯ是氧量傳感器NＯ結(jié)合血紅素里的亞鐵，一結(jié)合便與分子氧反應(yīng)，生成硝酸根離子，并把血紅素鐵氧化成高鐵。研究者強調(diào)，ＮＯ－酶絡(luò)合物與氧的反應(yīng)是阻抑酶再次進入生化合成歷程的唯一途徑。這就建立了一種不尋常的條件，使借助氧來分解亞鐵－ＮＯ絡(luò)合物成為穩(wěn)態(tài)下的催化劑的定速步驟，而決定速度的并非電子轉(zhuǎn)移、產(chǎn)物離去或任何其他通常決定生物合成反應(yīng)的步驟，因而，通過生成亞鐵－ＮＯ絡(luò)合物，ＮＯＳ事實上成為氧的“傳感器”，能迅速改變正被合成的ＮＯ的量，以反映組織中氧量的變化。ＮＯＳ并非唯一一種能夠反映ＮＯ受氧濃度變化影響的含血紅素蛋白質(zhì)，血紅蛋白也具有這種性質(zhì)[Ｎａｔｕｒｅ，３８０，２２１（１９９６）]。血紅蛋白結(jié)合或釋放氧或者與ＮＯ和氧反應(yīng)生成硝酸根離子會引起整個血紅蛋白四聚體的變化。這些變化導(dǎo)致位于蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基的硫基結(jié)合或釋放ＮＯ。在血紅蛋白的巰基和血紅蛋白之間的相互反應(yīng)是極其巧妙的，此中，血紅蛋白會發(fā)生一次變構(gòu)，引起巰基釋放ＮＯ，該過程則既受配體的結(jié)合力的控制，又受血紅素的自旋態(tài)的控制。ＮＯ調(diào)節(jié)血壓這些研究者從而鬧清了一個長期未解的謎：ＮＯ一個重要的生物化學(xué)功能—調(diào)節(jié)血壓。血管內(nèi)壁細(xì)胞含有它們自己的ＮＯＳ，它們合成ＮＯ，合成的ＮＯ與鄰近的平滑肌細(xì)胞里的含血紅素的酶—鳥苷酸環(huán)化酶反應(yīng)，使肌肉松馳，使血管擴張，但是研究者們感到困惑不解的是，以微摩爾量級計的ＮＯ是如何能夠到達肌肉的，因為血管本身所含的血紅蛋白的濃度達毫摩爾量級，足以清除和破壞這些ＮＯ。后來，這批美國Ｄｕｋｅ大學(xué)的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)ＮＯ在血紅蛋白的血紅素里是通過生成亞硝基硫醇而受到保護免于轉(zhuǎn)化為硝酸根的。最令人驚異的是這種亞硝基硫醇是ＮＯ跟血紅蛋白本身的半胱氨酸基反應(yīng)生成的，每一個血紅蛋白的四聚體含有４個血紅素基團和兩個半胱氨酸基，每個半胱氨酸基有一個硫醇基，可以結(jié)合一個ＮＯ分子。這些半胱氨酸在生物進化成鳥類和哺乳動物時得以保存，細(xì)胞生物學(xué)家長期以來就猜疑它們具有某種重要功能而一直未能得解。使用化學(xué)熒光技術(shù)能夠測量納摩級濃度的生物體系里的亞硝基硫醇。研究者們指出，ＮＯ既與血紅素鐵結(jié)合，又與半胱氨酸的巰基結(jié)合。在氧的存在下，亞鐵血紅素的上ＮＯ被氧化成硝酸根。血紅素鐵的氧化態(tài)的變化會影響半胱氨酸中結(jié)合著的ＮＯ，使它釋放ＮＯ。他們觀察到血紅細(xì)胞上的這一基團被轉(zhuǎn)移到一個小肽的硫氫基上，例如轉(zhuǎn)移到谷胱甘肽上，后者將把ＮＯ攜出細(xì)胞。當(dāng)氧被結(jié)合到血紅素鐵上時，半胱氨酸會結(jié)合更多的ＮＯ。血紅蛋白結(jié)合氧會使整個四聚體的構(gòu)型發(fā)生變化，由此會使半胱氨酸上的硫氫基更容易結(jié)合ＮＯ。研究者們測定由老鼠的動脈和靜脈取來的血液發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血液被輸送到肺部時，它既從血紅素中心取得氧，又從血紅蛋白的半胱氨酸殘基上取得ＮＯ，而返回到肺部的血液里的血紅蛋白則既耗盡了氧又耗盡了ＮＯ，研究者們指出。富氧血紅蛋白清除掉血管里的ＮＯ、但是卻使血壓發(fā)生顯著的變化，因為該分子立即使其他分子釋放ＮＯ，從而引起血管松弛。血紅蛋白運輸氧時同時也釋放ＮＯ，可能因此有助于擴充毛細(xì)管，使氧能夠被輸送到需要的細(xì)胞中去。另有人認(rèn)為，ＮＯ的許多信號功能之一可能涉及ＮＯ從硫氫基釋放或與之結(jié)合。許多肽和蛋白質(zhì)能夠形成亞硝基硫氫基，雖然Ｓ－亞硝酰血紅蛋白是第一個被證實的，還應(yīng)當(dāng)有許多蛋白質(zhì)，例如組織的血纖維蛋白溶酶原的活化劑和Ｎ－甲基－Ｄ－天門冬酸酯的受體，也可能具有通過Ｓ－亞硝?；饔脕碚{(diào)節(jié)的功能，正如通過磷酸化調(diào)節(jié)的其他蛋白質(zhì)一樣。但是這種說法與某些化學(xué)家的說法是相左的。后者提出動力學(xué)的論據(jù)來反對在生理條件下生成Ｓ－亞硝基硫醇。美國威斯康新大學(xué)的研究者們研究了可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的調(diào)節(jié)機理，該酶與ＮＯ結(jié)合導(dǎo)致血管擴充。鳥苷酸環(huán)化酶也被卷入其他ＮＯ信號路徑，包括某些在中樞神經(jīng)的神奇莫測的學(xué)習(xí)和記憶的形成中起作用的路徑，應(yīng)用可見光譜和拉曼光譜，這些研究者研究了當(dāng)ＮＯ結(jié)合時發(fā)生在鳥苷酸環(huán)化酶中的血紅素鐵的配位環(huán)境中的變化，據(jù)說。當(dāng)ＮＯ結(jié)合時有一個組氨酸配體從血紅素中被置換掉了，結(jié)果生成了血紅素－亞硝酸絡(luò)合物，該絡(luò)合物不含任何來自蛋白質(zhì)的配體。一氧化碳也能夠結(jié)合血紅素鐵，但是后者不置換組氨酸配體，也不會使酶活比。為了確定置換組氨酸是否使鳥昔酸環(huán)化酶活化的重要條件，研究者們用其他具有不同配位優(yōu)選性的金屬卟啉來替換該酶的血紅素基團。例如，Co(=2\*ROMANII)卟啉比起血紅素更不喜歡同時結(jié)合ＮＯ和組氨酸。研究發(fā)現(xiàn)，跟天然的酶一樣，含Co(=2\*ROMANII)卟啉的類似物在結(jié)合ＮＯ時也被活化。相反Ｍｎ（=2\*ROMANII）卟啉的類似物能夠同時結(jié)合ＮＯ和組氨酸，不能因結(jié)合ＮＯ而被活化。鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合NO后的形體在隔絕空氣時十分穩(wěn)定，但是在空氣中漸漸失活。失活是跟被結(jié)合的ＮＯ氧化成硝酸根和亞鐵血紅素氧化成高鐵血紅素有關(guān)。這意味著，這個反應(yīng)可能使酶在體內(nèi)失效。ＮＯ分子在昆蟲吸血時的作用在阿里桑那大學(xué)的一批研究者報告說、至少有一類血紅蛋白可以可逆地結(jié)合和釋放ＮＯ。吸血昆蟲在吸血時用這類酶擴張其獵物的血管。這些蛋白質(zhì)的血紅素里的鐵是高鐵而不是亞鐵。它對ＮＯ的結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)小于亞鐵血紅素。因此在生理條件下ＮＯ能夠從絡(luò)合物里解離出來。同一大學(xué)的昆蟲化學(xué)家則發(fā)現(xiàn)在兩類不同的昆蟲臭蟲和錐鼻蟲的唾液里發(fā)現(xiàn)一類叫做Nitrophorin的化合物。在ｐＨ為５．５（唾液值)時，ＮＯ結(jié)合牢固。當(dāng)ｐＨ為７.35（其獵物的血液值）時ＮＯ結(jié)合松馳。ｐＨ值改變引起ＮＯ結(jié)合與釋放的現(xiàn)象有助于確保昆蟲得到足夠的血。鑒于這兩類昆蟲的蛋白質(zhì)相去甚遠(yuǎn)，因此它們可能彼此無關(guān)地用同一種方法來增加它們吸血的效率。ＮＯ和超氧離子的反應(yīng)ＮＯ的另一重要生物學(xué)反應(yīng)是它與超氧離子O2-反應(yīng)，反應(yīng)的可能產(chǎn)物是過氧亞硝酸根離子ＯＮＯＯ-。在生理ｐH值下，該離子的半衰期１－２秒，因此從未在細(xì)胞間檢出該產(chǎn)物。過氧亞硝酸棍離子被認(rèn)為是人體有炎癥、中風(fēng)、心臟病和風(fēng)濕病引起大量細(xì)胞和組織毀壞的原因。它們在巨噬細(xì)胞里的受控生成是巨噬細(xì)胞能夠殺死癌細(xì)胞和入侵的微生物的重要原因。懷俄明大學(xué)的研究者用生物擬態(tài)法合成了過氧亞硝酸的四甲基銨鹽。合成反應(yīng)是計量的，在液氨里進行，以保證超氧離子在溶液中存在，并可避免生成亞硝酸根和硝酸根的副產(chǎn)物。研究者們正用譜學(xué)方法和簡單的反應(yīng)來探究過氧亞硝酸根離子的基本性質(zhì)。例如它的基態(tài)究竟是順式的還是反式的，這兩種構(gòu)型之間轉(zhuǎn)化的能閾有多大，以及它和硝酸根的異構(gòu)化反應(yīng)等。例如，他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)16Ｏ標(biāo)記的過氧亞硝酸根在18Ｏ標(biāo)記的水中分解時，生成的硝酸根有關(guān)11％18O。由此可見，該反應(yīng)絕不是簡單的異構(gòu)化反應(yīng)。正在試驗中的釋放ＮＯ的新藥盡管像硝酸甘油這樣的給出ＮＯ的藥物已經(jīng)用了一百多年，至今仍然沒有一種完美的藥物。例如，用于治療心絞痛的硝酸甘油必須經(jīng)還原產(chǎn)生ＮＯ。因連續(xù)使用硝酸甘油會造成人體供應(yīng)的還原劑的一時匱乏而降低藥效。又例如手術(shù)時用于控制血壓的一種金屬亞硝酰化合物—硝普鹽會釋放出有毒的副產(chǎn)物氰離子，新近研究的新藥Diazeniumdiolates可能是一類較好的ＮＯ給體，可用于多種威脅生命的疾病。該陰離子以固態(tài)存在時是穩(wěn)定的，當(dāng)溶解時則釋放出２個摩爾的ＮＯ，如下式所示： 通過改變該陰離子的有機基團Ｘ可以合成的這類藥物的種簡直是無限的。所有已經(jīng)合成的藥物溶解釋放ＮＯ分子的反應(yīng)均為一級反應(yīng)。在生理條件下，溶解后的分子的半衰期為３秒至２０小時不等。該新藥正在研究的應(yīng)用之一是用于心臟冠狀動脈擴張術(shù)，在手術(shù)中打開的冠狀動脈會導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增生和血小板聚集。ＮＯ可將兩者阻抑住。一個試驗是手術(shù)時在老鼠的冠狀動脈血管外壁敷以含該新藥的膠。發(fā)現(xiàn)在手術(shù)兩周后組織的增生明顯受到抑制。還有一則試驗是將該新藥注射到豬的心包內(nèi)?？疾焓欠衲軌蛟谙喈?dāng)長的時間內(nèi)明顯阻抑組織增生，美