活體動物體內(nèi)成像技術

活體動物體內(nèi)成像技術第1頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術生物發(fā)光：用熒光素酶基因標記細胞或DNA.熒光技術：采用熒光報告基團（GFP、RFP,Cy5及Cy7等）進行標記。第2頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一

技術優(yōu)勢

●利用一套非常靈敏的光學檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。●通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學過程。第3頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一●傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù),得到多個時間點的實驗結果?！窨梢姽怏w內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。第4頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一●這一技術對腫瘤微小轉移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法,非常安全?！褚蚱洳僮鳂O其簡單、所得結果直觀、靈敏度高等特點,在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等方面。第5頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一1.標記原理生物發(fā)光：是將Fluc基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強度與標記細胞的數(shù)目線性相關。第6頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一生物發(fā)光成像系統(tǒng)組成以精諾真公司的IVIS100為例,體內(nèi)可見光成像系統(tǒng)主要由三部分組成——（1）CCD鏡頭：選擇適當?shù)腃CD鏡頭，對于體內(nèi)可見光成像是非常重要的。（2）成像暗箱：像暗箱屏蔽宇宙射線及一切光源，可以使暗箱內(nèi)部保持完全黑暗，CCD所檢測的光線完全由被檢動物體內(nèi)發(fā)出，避免外界環(huán)境的光污染。（3）軟件系統(tǒng)：軟件系統(tǒng)負責儀器控制和圖像分析。第7頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一精諾真（Xenogen）活體化學發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)

第8頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一Lightools活體熒光成像系統(tǒng)第9頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一標記細胞的方法:通過分子生物學克隆技術,將熒光素酶的基因插到預期觀察的細胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細胞技術的篩選,培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株。結果觀察：將標記好的細胞注入小鼠體內(nèi)后,觀測前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標記的細胞發(fā)光30-45分鐘。應用一個高度靈敏的制冷CCD相機及特別設計的成像暗箱和成像軟件。第10頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一2.光學原理

基本原理在于光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器量化檢測到的光強度，同時反映出細胞的數(shù)量。利用靈敏的活體成像系統(tǒng)最少可以看到皮下的500個細胞，當然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細胞數(shù)是不同的。在相同的深度情況下,檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關系。第11頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一3.實驗過程

通過分子生物學克隆技術,應用單克隆細胞技術的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預期觀察的細胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白的細胞株。第12頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一典型的成像過程小鼠經(jīng)過麻醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動關閉照明燈,在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。第13頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一4．熒光成像功能

熒光發(fā)光：是通過激光激發(fā)熒光基團而產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed及其它熒光報告基團，標記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。

第14頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一●熒光信號遠遠強于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發(fā)光。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。●熒光成像有其方便，便宜，直觀，標記靶點多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點，在一些植物分子生物學研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應用。第15頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一●最近許多文獻報道，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細胞或動物進行雙重標記，用成熟的熒光成像技術進行體外檢測，進行分子生物學和細胞生物學研究；然后利用生物發(fā)光技術進行動物體內(nèi)檢測，進行活體動物體內(nèi)研究。第16頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一技術應用

通過活體動物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測到疾病或癌癥的發(fā)展進程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應，并可用于病毒學研究、構建轉基因動物模型、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細胞體外檢測等領域。具體應用如下：第17頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一1.標記細胞

（1）癌癥與抗癌藥物研究直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估。活體生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及自發(fā)瘤?；铙w成像技術提高了檢測的靈敏度，即使微小的轉移灶也能被檢測到（可以檢測到體內(nèi)102個細胞的微轉移）。第18頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一第19頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一（2）免疫學與干細胞研究●將熒光素酶標記的造血干細胞移植入脾及骨髓，可用于實時觀測活體動物體內(nèi)干細胞造血過程的早期事件及動力學變化?！裼醒芯勘砻鳎瑧脦в猩锇l(fā)光標記基因的小鼠淋巴細胞，檢測放射及化學藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉移及抗腫瘤免疫治療中復雜的細胞機制。●應用可見光活體成像原理標記細胞，建立動物模型，可有效的針對同一組動物進行連續(xù)的觀察，節(jié)約動物樣品數(shù)，同時能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉移途徑及抗性蛋白表達的改變。第20頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一（3）細胞凋亡當熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性，細胞不能發(fā)光，而當細胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3在特異識別位點切割去掉抑制蛋白，恢復熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細胞凋亡相關事件。也可以通過使用特殊的底物，DEVD-luciferin，當發(fā)生細胞凋亡時，活化的caspase-3會切斷DEVD與luciferin的連接，恢復熒光素酶與luciferin的相互作用而發(fā)光。第21頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一2.標記病毒

（1）病毒侵染

以熒光素酶基因標記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結的侵和病毒從血液系統(tǒng)進入神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標記，用于觀察病毒對機體的侵染過程。第22頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一用RFP標記病毒，動態(tài)檢測病毒在體內(nèi)的復制過程。

例：InvivoNear-InfraredFluorescenceImagingofIntegrin_v_3inBrain

TumorXenografts

第23頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一（2）基因治療●可應用熒光素酶基因作為報告基因用于載體的構建，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達。這種非侵入方式具有容易準備、低毒性及輕微免疫反應的優(yōu)點。●熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中,用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運輸和基因治療情況。第24頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一第25頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一3.標記細菌（1）細菌侵染研究可以用標記好的革蘭氏陽性和陰性細菌侵染活體動物,觀測其在動物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應。（2）抗生素藥物利用標記好的細菌在動物體內(nèi)對藥物的反應，醫(yī)藥公司和研究機構可用這種成像技術進行藥物篩選和臨床前動物實驗研究。第26頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一4.基因表達和蛋白質(zhì)相互作用

（1）組織特異性基因表達熒光素酶是一類生物發(fā)光酶，一種細胞可被這兩種熒光素酶標記:renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達的啟動子驅(qū)動,作為內(nèi)參，反應細胞數(shù)量的變化;firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細胞數(shù)量變化的影響后就可反應特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達活性。第27頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一（2）蛋白質(zhì)相互作用觀察細胞中或活體動物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導入細胞或動物體內(nèi)表達為融合蛋白。當兩種蛋白有強相互作用時，表達的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應用此原理亦可用于研究細胞信號傳導途徑。第28頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一（3）阻斷RNA

通過對比生物發(fā)光的變化，驗證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達。第29頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一5.轉基因動物模型（1）基因表達為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。利用其表達產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應目的基因的表達情況，從而實現(xiàn)對目的基因的研究?？捎糜谘芯縿游锇l(fā)育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導特定基因表達，以及其它生物學事件引起的相應基因表達或關閉。第30頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一（2）各種疾病模型研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標記，同時轉入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等?？商峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實時表達和對候選藥物的準確反應，還可以用來評估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。第31頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一

活體動物體內(nèi)成像技術常見問題

第32頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一關于細胞標記和熒光素酶的特性

1.熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素(Luciferin)。2.熒光素酶的發(fā)光特性如何？熒光素腹腔注射老鼠后約一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，十分鐘后強度達到穩(wěn)定的最高點。在最高點持續(xù)約20-30分鐘后開始衰減，約三小時后熒光素排除，發(fā)光全部消失。最好的檢測時間是在注射后15到35分鐘之間第33頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一第34頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一3.底物熒光素(Luciferin)是如何進入小鼠體內(nèi)的？需要多少？熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進入小鼠體內(nèi)的，約一分鐘就可以擴散到小鼠全身。大部分發(fā)表的文章中，熒光素的濃度是150mg/kg(見下圖)。20克的小鼠需要3毫克的熒光素，價錢約兩到三美元。常用方法是腹腔注射，擴散較慢，開始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長。若進行熒光素靜脈注射，擴散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間很短。4.熒光素的體內(nèi)代謝過程不同品牌的熒光素底物的代謝過程不太一樣，使用前最好做一些體外試驗，做一個標準曲線。第35頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一第36頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一5.兩次觀察間隔時間最短為多長時間？觀察時間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內(nèi)有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結果的影響。6.熒光素酶基因，熒光素酶，熒光素底物有多大？可以透過血腦屏障嗎？熒光素酶有554個氨基酸，約50KD。熒光素酶的底物熒光素，約280道爾頓。熒光素的水溶性和脂溶性都非常好,很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

第37頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一7.做體內(nèi)實驗的luciferin與體外實驗的是不是一樣，如何購買？最小包裝多大？體內(nèi)生物發(fā)光是用的是D-Luciferin，有1g或小到100mg的包裝。8.如何保證熒光素酶(Luciferase)的穩(wěn)定性？熒光素酶基因是插到細胞染色體內(nèi)的，當細胞分裂、轉移、分化時,熒光酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。熒光素酶的半衰期約三個小時,所以只有活細胞才能夠持續(xù)表達熒光素酶。第38頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一9.標記的腫瘤接種以后，會發(fā)生luciferase的丟失嗎？沒有正式的報道丟失Luciferase的情況。丟失的可能性及量非常小，不會影響實驗結果。一些實驗報道的結果中，標記的細胞在動物體內(nèi)存活幾年的時間還可以持續(xù)發(fā)光，說明Luciferase基因的標記非常穩(wěn)定。10.在invitro的細胞培養(yǎng)中，為什么要經(jīng)常用抗生素篩選？熒光素酶基因標記的細胞株是經(jīng)過單克隆篩選培養(yǎng)過的穩(wěn)定的細胞株。體外培養(yǎng)過程中，不篩選也可以，只要時間不是很長，接種代數(shù)不要很多。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)基因丟失的情況。但若接種的代數(shù)過多，建議用藥物篩選一段時間或從原始的細胞株培養(yǎng)以保證細胞發(fā)光的強度。第39頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一11.可以用腫瘤塊而不是細胞接種嗎？可以先用標記的細胞在皮下接種，然后從皮下取出腫瘤塊進行原位接種。12.熒光素酶基因在標記的細胞中有多少個COPY，在什么位點？細胞中的copy數(shù)目，和標記的位點對于實驗沒有任何影響，后來的實驗中基本不進行那樣的研究。13.標記細胞與標記基因所用的啟動子有何不同？標記細胞一般用在細胞內(nèi)能穩(wěn)定表達的啟動子,顯示細胞的數(shù)目。標記基因一般用此基因的啟動子，與此基因平行表達,顯示此基因的表達數(shù)目。第40頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一14.熒光素酶的表達高低與所用啟動子的活性有關嗎？有關，啟動子的活性高，則熒光素酶的表達高，啟動子的活性低，則熒光素酶的表達低。還可以根據(jù)此原理，用特定的啟動子驅(qū)動熒光素酶，來觀察該啟動子在活體動物體內(nèi)的特定條件下的表達情況，并檢測影響該啟動子表達的因素。這正體現(xiàn)了應用活體成像技術研究的優(yōu)勢。第41頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一15.有幾種常用的熒光素酶？特性如何？常用的有兩種熒光素酶，Luciferase和Renilla熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長在540-600nm，后者所發(fā)的光波長在460-540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快。大部分的發(fā)表文章通常使用前者用作報告基因，也有一些文章使用兩者進行雙標記。第42頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一16.組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎？可以，但熒光酶的體外活性保持時間比較短，約幾十分鐘。有相關的文獻。17.標記好的細胞的熒光素酶是隨機還是插入固定的位點？插入的位點是隨機的，但每一個構建好的細胞株我們都做過詳細的分析，與其母細胞株進行詳細的比較，證明熒光素酶的插入對細胞的各種特性(包括生長周期,成瘤性等)沒有造成影響。第43頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一18.能標記病毒嗎？能標記病毒的某一個基因嗎？可以標記病毒，由于病毒在核酸結構上的特性，每個病毒標記的方法不一樣，具體的可以參見有關文獻。還沒有看到標記病毒某一個基因的報道，但理論上講，將熒光素酶基因與想標記的基因平行表達，可以標記任何基因。19.細菌標記問題對于細菌標記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標記的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達。第44頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一關于儀器的特性等問題20.為何活體成像技術能看到體內(nèi)發(fā)出的可見光？兩個主要原因使可見光成像技術能夠看到體內(nèi)發(fā)出的微弱的可見光。一是高靈敏度的制冷CCD鏡頭，可達到零下-105°C，使體內(nèi)發(fā)出的非常少的光子也能夠檢測到。二是絕對密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括宇宙射線在內(nèi)的所有光線。21.正常成體小鼠可以看到體內(nèi)發(fā)光嗎？是否不需要裸鼠？可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在與對可見光的穿透性不同，我們的技術可以看到成體正常老鼠的體內(nèi)發(fā)光。這正是這項技術的價值所在?？梢姽獾拇┩改芰υ?-4cm，所以大鼠也可以作為活體成像的動物，并有很多關于大鼠的文章。第45頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一22.能檢測在組織內(nèi)部的發(fā)光嗎？光能透過肌膚多深？可以。若有發(fā)光足夠強的標記細胞，在老鼠體內(nèi)任何一個地方都能看到約一立方毫米的細胞瘤(約106細胞)。穿透性可達到3-4CM(小鼠身體厚度約7-8CM)。23.儀器靈敏度如何？儀器對發(fā)光細胞檢測的靈敏度與細胞發(fā)光的強度有關。在標記細胞活躍發(fā)光的情況下，儀器可以檢測到最少100個皮下接種的發(fā)光細胞。若細胞在體內(nèi)位置深(如原位種植)，比如內(nèi)臟，最少能檢測到的細胞數(shù)目需要多一些。一般每增加0.5cm可檢測到的最少細胞數(shù)增加一個數(shù)量級。第46頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一24.能檢測分散在各處的單個細胞嗎?可以檢測到流體的細胞，只要細胞總數(shù)達到100以上。許多文章，其中用熒光素酶標記了T細胞,NK細胞,造血干細胞和其他淋巴細胞。在這些標記的細胞總數(shù)達到一百以上時，儀器可以觀察到信號。25.活體成像技術如何定量分析？活體可見光成像技術采取絕對光子數(shù)的計算方法，記錄單位時間內(nèi)、單位面積、單位角度接受到的光子數(shù)。這樣，不同時間、不同儀器的測量結果可以進行比較，具有絕對的定量意義。每一個新標記的細胞株都要進行全面的定量分析才能用于定量實驗，其中包括在體外和體內(nèi)固定位置細胞發(fā)光的標準曲線。第47頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一26.不同的組織對光的吸收程度不一樣，不同的組織之間能進行定量研究嗎？不能。目前的文獻都是同樣的組織比較，進行同樣組織的前后不同時間的定量分析。27.熒光素酶的發(fā)光強度是否同細胞的數(shù)量成正比？是的，熒光素酶的發(fā)光強度同標記的靶點,包括細胞、基因、細菌和病毒的數(shù)量成正比。密西根大學BrianRoss發(fā)表的一篇文章專門研究了這個問題。確定熒光素酶的發(fā)光強度與細胞數(shù)成正比關系，并且線性關系到0.9以上。第48頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一28.儀器的解析度如何？分辨率如何？儀器的最高解析度在0.1毫米左右。由于可見光是漫射光，在體內(nèi)走的路線不是直線，所以該儀器的體內(nèi)光源的分辨率不是很好，通過該儀器觀察的發(fā)光圖片不能代表發(fā)光物質(zhì)的結構信息，在動物體表所捕捉的發(fā)光信號只能代表發(fā)光的強度和大概的位置。小動物CT和MRI，在這方面具有優(yōu)勢，因為放射線走的路線很直。第49頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一29.能定位在哪個臟器嗎？憑什么？當進行腫瘤轉移研究的實驗時，在觀察期間，不殺死動物，如何判斷某一部位發(fā)光是由于皮膚、皮下組織，肌肉，臟器還是骨骼的腫瘤轉移造成的發(fā)光？特別是對于一些較小的臟器，如淋巴結轉移。此技術無法直接定位標記細胞和基因所在的組織和器官。但是實驗人員憑經(jīng)驗，可以靠發(fā)光細胞在老鼠的身體位置推斷標記細胞或基因所在的臟器。若需要證實,還需要將老鼠解剖，進行體外檢測。第50頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一30.拍攝普通照片的和生物發(fā)光照片的是一個CCD鏡頭嗎?是,只不過爆光時間和快門不一樣。31.鏡頭那么低溫度，動物不會凍死嗎？低溫只是在CCD鏡頭的小環(huán)境內(nèi)。其它范圍內(nèi)都是室溫。32.使用麻醉機相對于腹腔注射麻醉有什么優(yōu)點？麻醉系統(tǒng)可以對小鼠的麻醉情況包括時間，程度等有更精確的控制。使用起來也會更加方便。33.熒光配件相對于其他公司的熒光的優(yōu)勢在哪里？相對寬的應用范圍，可以觀察波長在400-900nm的熒光，因此適用于GFP及各種熒光染料的標記。還有一套12張專門的濾光片用來消除非特異性的背景光。并且其成像速度快，適合大批量的實驗。第51頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一34.關于生物發(fā)光與熒光及其它技術的比較

優(yōu)點缺點

生物發(fā)光高靈敏度信號較弱,需要靈敏的CCD鏡頭對環(huán)境變化反應迅速需要注入熒光素成像速度快，圖像清楚儀器精密度要求高在體內(nèi)可檢測到102細胞細胞或基因需要標記

熒光多種蛋白及染料可用于非特異性熒光限制了靈敏度多重標記，標記相對簡單體內(nèi)檢測最低約106細胞可同時用于FACS分類需要不同波長的激發(fā)光未來可能用于人體很難精確體內(nèi)定量第52頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一35.為什么用熒光素酶,而不是用綠色熒光蛋白來檢測體內(nèi)發(fā)光?一方面是熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強近一百倍。另一方面,熒光素酶是靠酶和底物的相互反應發(fā)光，特異性很強。這樣一來，得到的信噪比很高。而熒光蛋白需要激發(fā)光來產(chǎn)生反射光。老鼠的毛皮、肌膚以及一些食物都會產(chǎn)生非特異性熒光，造成很強的非特異性背景光，得到的信噪比很小。雖然熒光蛋白的發(fā)光強度很高，大量應用于體外檢測；但熒光酶標記的方法更適合于體內(nèi)檢測。熒光酶體內(nèi)檢測的靈敏度要比熒光蛋白在體內(nèi)的靈敏度至少高三個數(shù)量級(1000倍)。第53頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一36.發(fā)光的波長與體內(nèi)的穿透性如何關系？熒光素酶發(fā)出的光主要是偏紅光，與綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光不同。熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強近一百倍。因為光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域,大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。第54頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一37.相對于傳統(tǒng)技術，生物發(fā)光成像技術的優(yōu)勢在哪些研究領域？該技術是一項在某些領域有很大不可替代優(yōu)勢的技術，但是并不是萬能的技術。與傳統(tǒng)技術相比，腫瘤轉移研究，基因治療，流行病學的發(fā)病學研究，干細胞示蹤，白血病的相關研究等是該技術非常有優(yōu)勢的領域。在藥物開發(fā)方面，用該技術進行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過一系列轉基因疾病動物模型，來快速直觀的進行相關疾病的發(fā)病機理和藥物篩選研究。

第55頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一38.生物發(fā)光成像不能標記的領域？小分子藥物，多肽等。這些方法現(xiàn)今為止的最好的標記方法還是以放射性標記。39.生物發(fā)光成像和小動物CT比較有什么特點和優(yōu)勢？小動物CT的基本原理是利用X射線成像，通過對所觀察對象的密度變化，進行動物內(nèi)部結構方面的研究。他的優(yōu)點是分辨率高，不需標記。缺點是特異性差，在腫瘤很小時無法區(qū)分腫瘤細胞和正常細胞，并且對于腫瘤細胞的活躍程度不敏感。如2005年1月JCI的一篇關于乳腺癌骨轉移的文章里，詳細比較了小動物CT與生物發(fā)光成像在腫瘤轉移方面的靈敏度。小動物CT要在接種16天以后，成瘤很明顯后才能夠觀察到骨轉移的存在。而生物發(fā)光成像在接種后當天就可以實時觀察到癌細胞的轉移和走向。并且，小動物CT需要對動物有較強的X-射線照射，容易引起突變，對動物的生理有一定影響第56頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一40.小分子藥物的標記用熒光與PET，哪一個更好？如果用熒光蛋白，可以標記細胞或病毒。如果使用合適的熒光小分子，如Cyt5.5等，可以標記蛋白例如抗體等大分子或者多肽。但是再小的分子如小分子藥物等，只能用放射性同位素標記，用PET或SPECT的方法進行研究。因為即使熒光基團如Cyt5.5也會影響小分子藥物的藥理藥效和代謝活動。41.體內(nèi)可見光技術和其它體內(nèi)成像技術(PET,CT,及MRI)的比較簡單優(yōu)點：適用于小動物的研究，靈敏度高，特異性好，操作簡單，無放射性，價錢便宜。缺點：無法標記小分子藥物，暫不適用于人類和臨床(正在研究中)，分辨率低，體內(nèi)精確定位有限。

第57頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一42.可以用熒光素酶基因標記干細胞嗎？如何標記？可以，標記干細胞有幾種方法。一種是標記組成性表達的基因，做成轉基因小鼠，干細胞就被標記了，從此小鼠的骨髓取出造血干細胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術示蹤造血干細胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標記神經(jīng)干細胞。以上內(nèi)容都有相關的文獻報道。第58頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一43.該技術在抗腫瘤新藥研究方面的應用如何？在用該技術進行抗腫瘤新藥的研究方面，主要是藥效學評價。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術有更高的靈敏度，當用傳統(tǒng)的方法，還不能檢測到瘤塊時，用該技術已經(jīng)可以檢測到很強的信號。還有由于該技術只是檢測活躍的細胞，那些已經(jīng)凋亡的癌細胞是檢測不到的，而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常的癌細胞與凋亡的癌細胞，所以該技術可以比傳統(tǒng)技術更早的發(fā)現(xiàn)藥物的療效，比傳統(tǒng)方法更靈敏。目前已經(jīng)應用該技術進行的抗腫瘤藥效研究的有SU11248（乳腺癌新藥），opotecan（已經(jīng)上市的抗腫瘤）等。第59頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一44.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的關系，如何研究？PNAS(美國科學院院報)上發(fā)表的一篇文章介紹，可利用體內(nèi)可見光成像技術研究活體動物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用。具體方法是：將分開時都不單獨發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個蛋白質(zhì)之間有相互作用,，熒光酶的C端和N端就會被帶到一起,產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象45.可以研究藥物對蛋白質(zhì)相互作用嗎？可以。在活體條件下應用該技術研究藥物對蛋白質(zhì)相互作用的影響?？梢园言隗w外實驗中無法模擬的活體環(huán)境對蛋白質(zhì)相互作用的影響也計算在內(nèi)（PNAS04）。第60頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一46.可以研究蛋白質(zhì)核運輸嗎？可以。研究方法類似于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質(zhì)的基因，另一端接肯定在細胞核內(nèi)表達的蛋白的基因，當核外的蛋白運輸?shù)胶藘?nèi)時，就會導致熒光素酶N斷、C端靠近，恢復發(fā)光。47.可以用該技術研究基因表達嗎？可以，研究基因表達可以從影響基因表達的各個不同的層面進行相關的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk細胞分裂周期的表達）,興趣基因啟動子控制的熒光素酶（Catenin在腫瘤轉移的信號傳導機制）,iRNA方式（HCV-luc的iRNA抑制表達）,和轉基因動物（NFkB在Hypoxia的表達）等方法。第61頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一48.細胞凋亡的研究PNAS(美國科學院院報)上發(fā)表的一篇文章介紹，可利用體內(nèi)可見光成像技術直接觀察活體動物體內(nèi)的細胞凋亡。具體方法是：用分子生物學方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發(fā)光的蛋白(如雌激素)，但在其連接處加上CASPASE(細胞凋亡時特異表達的一種酶)的酶切點。細胞發(fā)生凋亡時，表達CASPASE，切開抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光酶開始發(fā)光。詳細內(nèi)容見文章。第62頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一49.該技術只是能示蹤細胞的走向，而不能進行相關的機理研究？不對。該技術最初的應用是在觀察腫瘤細胞、病原微生物或干細胞的走向，分布等，但是目前隨著該技術的普及，其應用已經(jīng)擴展到很多方面，原來只能在分子水平上研究的內(nèi)容，現(xiàn)在也可以在整體動物水平上進行更接近活體環(huán)境狀態(tài)的研究，如蛋白質(zhì)相互作用，細胞凋亡，基因表達等等?；旧习逊肿由飳W在體外的一些研究方法在體內(nèi)進行實現(xiàn)。由于體內(nèi)與體外的各種微環(huán)境上的差異，造成體外實驗結果對活體生物機理研究的局限性，相信在整體水平的研究，必將有廣闊的發(fā)展空間。第63頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一50.在藥物臨床前研究中的應用如何？利用活體成像技術高靈敏度，觀察方便的特點，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過給予腫瘤接種的小鼠不同的劑量，并不同的給藥時間、不同的給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量并給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。第64頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一51.相對于傳統(tǒng)技術，在腫瘤學研究中的優(yōu)勢在哪里？有更高的靈敏度，可以定量研究，可以方便的觀察腫瘤轉移與復發(fā)的情況，可以避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異，可以節(jié)省動物的成本。并且應為這項技術的超靈敏性，微小的腫瘤轉移兆（少到100多個細胞）就可以檢測到。比用傳統(tǒng)方法可以檢測到的靈敏度大大提高。也可應用轉基因技術制作自發(fā)腫瘤模型從事相關的研究。第65頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一52.如何利用該技術研究藥物代謝？標記與藥物代謝有關的基因，比如CYP3A4等，研究不同的藥物對該基因表達的影響，從而可以間接知道相關藥物在體內(nèi)代謝的情況。并且，小分子及多肽藥物也可以利用熒光素（如Cyt5.5等）標記，觀察它們在動物體內(nèi)的走向，變化及代謝等。53.如何進行相關疾病機理的研究？可以標記與某種疾病密切相關的基因，做成轉基因小鼠，通過特定的藥物作用或其他條件下，該基因表達的變化，來推測該疾病的發(fā)病機理，藥物對該疾病治療的效果等。第66頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一54.在中醫(yī)學方面的應用前景如何？由于該技術在整體動物水平上觀察生物學變化，與中醫(yī)的整體觀念有些相似。目前，有很多中藥在治療疾病上有很好的療效，但是由于其復雜的組分，復雜的作用機理，很難用目前的分子水平的研究解釋清楚。如果從宏觀的水平，根據(jù)所研究內(nèi)容的不同，應用該技術的一些疾病模型，從基因表達等方面觀察某些中藥的治療效果，將是一個不錯的方向。第67頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一55.在免疫學領域應用如何？觀察流體細胞在體內(nèi)的動向和變化使這個技術的一大優(yōu)勢?？梢詷擞浢庖呒毎?，如T細胞，NK細胞，觀察免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺死。也可以標記干細胞及異體細胞，觀察干細胞煙花和器官移植的研究。也有一些關于免疫因子的研究報道等。第68頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一56.在RNA阻斷方面的應用如何？可以標記siRNA嗎？可以用熒光素酶基因標記興趣基因，利用熒光素酶的iRNA觀察其對興趣基因的表達抑制（Nature2002）.也可以標記腫瘤細胞，間接觀察阻斷RNA對腫瘤細胞的識別和殺傷。57.相對傳統(tǒng)技術，在抗生素藥物篩選方面的優(yōu)勢如何？同一批老鼠持續(xù)觀察，避免個體間差異；有更高的靈敏度，可以在感染早期就進行活體觀察?？梢杂薪Y構信息，在活體動物整體上觀察感染途徑。定量，可以比較各個器官的感染程度，更直觀。第69頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一58.可以用熒光素酶基因標記干細胞嗎？如何標記？可以，標記干細胞有兩種方法。一種是標記組成性表達的基因，做成轉基因小鼠，干細胞就被標記了，從此小鼠的骨髓取出造血干細胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術示蹤造血干細胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標記干細胞。以上內(nèi)容都有相關的文獻報道。第70頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一59.組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎？可以，但熒光酶的體外活性保持時間比較短，約幾十分鐘。有相關的文獻。第71頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一60.熒光素酶的表達高低與所用啟動子的活性有關嗎？有關，啟動子的活性高，則熒光素酶的表達高，啟動子的活性低，則熒光素酶的表達低。還可以根據(jù)此原理，用特定的啟動子驅(qū)動熒光素酶，來觀察該啟動子在活體動物體內(nèi)的特定條件下的表達情況，并檢測影響該啟動子表達的因素。這正體現(xiàn)了應用活體成像技術研究的優(yōu)勢。第72頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一61.正常成體小鼠可以看到體內(nèi)發(fā)光嗎？是否不需要裸鼠？可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在與對可見光的穿透性不同，我們的技術可以看到成體正常老鼠的體內(nèi)發(fā)光。這正是這項技術的價值所在?？梢姽獾拇┩改芰υ?-4cm，所以大鼠也可以作為活體成像的動物，并有很多關于大鼠的文章。第73頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一62.為何能看到體內(nèi)發(fā)出的可見光？兩個主要原因使能夠看到體內(nèi)發(fā)出的微弱的可見光。一是高靈敏度的制冷CCD鏡頭，可達到零下-105°C，使體內(nèi)發(fā)出的非常少的光子也能夠檢測到。二是絕對密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括宇宙射線在內(nèi)的所有光線。第74頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一63.能檢測在組織內(nèi)部的發(fā)光嗎？光能透過肌膚多深？可以。若有發(fā)光足夠強的標記細胞，在老鼠體內(nèi)任何一個地方都能看到約一立方毫米的細胞瘤(約106細胞)。穿透性可達到3-4CM。第75頁，共87頁，2023年，2月20日，星期一64.儀器靈敏度如何？

儀器對發(fā)光細胞檢測的靈敏度與細胞發(fā)光的強