中國藥典高效液相色譜詳解演示文稿

中國藥典高效液相色譜詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有24頁\編輯于星期一（優(yōu)選）中國藥典高效液相色譜現(xiàn)在是2頁\一共有24頁\編輯于星期一一、對儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定

3儀器包括：儲液器泵進(jìn)樣器

色譜柱

檢測器現(xiàn)在是3頁\一共有24頁\編輯于星期一色譜柱反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。4現(xiàn)在是4頁\一共有24頁\編輯于星期一色譜柱填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。普通分析柱的填充劑粒徑一般在3~10μm之間。粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）。5現(xiàn)在是5頁\一共有24頁\編輯于星期一注意以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃流動相的PH值應(yīng)控制在2~8的。當(dāng)PH大于8時，可使載體硅膠溶解；當(dāng)PH小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用PH值大于8的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑當(dāng)需使用PH值小于2的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑6現(xiàn)在是6頁\一共有24頁\編輯于星期一檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。7現(xiàn)在是7頁\一共有24頁\編輯于星期一檢測器紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應(yīng)符合紫外—可見分光光度法（附錄VA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。8現(xiàn)在是8頁\一共有24頁\編輯于星期一二極管陣列檢測器（diodearraydetector，DAD）現(xiàn)在是9頁\一共有24頁\編輯于星期一特點：在任一時間內(nèi)，均可同時得到物質(zhì)在不同波長下的吸收情況，即三維圖譜現(xiàn)在是10頁\一共有24頁\編輯于星期一多組分混合物的三維圖譜現(xiàn)在是11頁\一共有24頁\編輯于星期一現(xiàn)在是12頁\一共有24頁\編輯于星期一現(xiàn)在是13頁\一共有24頁\編輯于星期一流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。14現(xiàn)在是14頁\一共有24頁\編輯于星期一二、系統(tǒng)適用性試驗

色譜系統(tǒng)的適用性試驗通包括理論板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子分離度和重復(fù)性是尤為重要。15現(xiàn)在是15頁\一共有24頁\編輯于星期一色譜柱的理論板數(shù)(n)用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）,按n＝16（tR/w）2或n=5.54(tR/Wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。16現(xiàn)在是16頁\一共有24頁\編輯于星期一分離度(R)

用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)?？梢酝ㄟ^測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到?，通過測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)進(jìn)行評價與控制。17現(xiàn)在是17頁\一共有24頁\編輯于星期一無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。除另外有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計算公式為：2(tR2－tR1)2(tR2－tR1)R＝───────或R＝──────────W1＋W21.70（W1，h/2＋W2,h/2）式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當(dāng)對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結(jié)果為準(zhǔn)。18現(xiàn)在是18頁\一共有24頁\編輯于星期一重復(fù)性用于評價連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0％；采用內(nèi)標(biāo)法時，通常配制相當(dāng)于80％、100％和120％的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計算平均校正因子。其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0％。19現(xiàn)在是19頁\一共有24頁\編輯于星期一拖尾因子（T）用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為：W0.05hT＝──────2d1式中W0.05h為0.05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應(yīng)在0.95～1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測量。必要時，應(yīng)在各品種項下對拖尾因子作出規(guī)定。20現(xiàn)在是20頁\一共有24頁\編輯于星期一測定法

(1)內(nèi)標(biāo)法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：As／Cs校正因子（f）＝─────AR／CR式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；CR為對照品的濃度。21現(xiàn)在是21頁\一共有24頁\編輯于星期一再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax含量（Cx）＝f·─────As內(nèi)／Cs內(nèi)式中Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；Cx為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度；As內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；Cs內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為較正因子。22現(xiàn)在是22頁\一共有24頁\編輯于星期一（2）外標(biāo)法：按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量含量（cX）=cR(AX/AR)式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或或自動進(jìn)