紫外誘變技術(shù)及抗藥性突變菌株的篩選

Ⅰ.紫外誘變技術(shù)用。菌株：大腸桿菌Escherichiaoli培育基：養(yǎng)分肉湯〔nutrientbroth〕固體和液體培育基生理鹽水等器皿：10ml1ml〔20~40粒，無(wú)菌漏斗〔內(nèi)有兩層擦鏡紙，無(wú)菌離心管，離心機(jī)，紫外誘變箱等。突變率僅為10-6~10-10左右。為了加大突變頻率，可承受物理或化學(xué)因素進(jìn)展誘發(fā)突變。物理因素中當(dāng)前使用得最以便且格外有效是UV，UV15w紫外滅菌燈，其光譜253.7nmDNA吸取波長(zhǎng)全都，可引起DNA分子構(gòu)造發(fā)生變化，特別法獲得突變株。1、對(duì)動(dòng)身菌株進(jìn)展解決，制備單細(xì)胞懸液；2、紫外線進(jìn)展解決；3、用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定致死率；〔一〕動(dòng)身菌株菌懸液制備動(dòng)身菌株移接穎斜面培育基，37℃培育16~24h；3℃110rpm振蕩培育過(guò)夜〔約1620~30%接種量轉(zhuǎn)接穎養(yǎng)分肉湯培育基，連續(xù)培育2~4h；4ml5ml離心管中，10000rpm3~5min4ml無(wú)菌生理鹽水，重懸浮菌體，再離心，棄去上清，重復(fù)上述環(huán)節(jié)用生理鹽水恢復(fù)成菌懸液；將上述菌懸液倒入裝有小玻璃珠無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，振蕩20~30min，以打散細(xì)胞；取誘變前0.5ml菌懸液進(jìn)展恰當(dāng)稀釋分別，取三個(gè)適當(dāng)稀釋度傾注肉湯平板，每1ml菌液，3724~36h，進(jìn)展平板菌落計(jì)數(shù)?！捕砋V誘變30min；取直徑6cm無(wú)菌培育皿〔含轉(zhuǎn)子，參與菌懸液5m，把握細(xì)胞密度為17~18個(gè)/ml；將待解決培育皿置于誘變箱內(nèi)磁力攪拌儀上，靜止1分鐘后啟動(dòng)磁力攪拌儀旋紐進(jìn)展攪拌，然后翻開(kāi)皿蓋，分別解決5s、10s、15s、30s、45s，照耀完畢后先蓋上皿蓋，再關(guān)閉攪拌和紫外燈；取0.5ml解決后菌液進(jìn)展恰當(dāng)稀釋分別，取三個(gè)適當(dāng)稀釋度傾注肉湯平板進(jìn)展計(jì)數(shù)〔避光培育。對(duì)平板菌落進(jìn)展計(jì)數(shù)，并計(jì)算死亡率。死亡率照耀前活菌數(shù)/ml照耀后活菌數(shù)/ml100%照耀前活菌數(shù)/ml附錄：試驗(yàn)流程圖動(dòng)身菌株↓斜面活化↓37℃，16~24hr振蕩培育↓37℃，110rpm過(guò)夜翻接↓37℃，110rpm2~4hr4ml離心收集菌體↓10000rpm，5min棄上清液↓4ml無(wú)菌生理鹽水離心↓10000rpm，5min棄上清液↓4ml無(wú)菌生理鹽水↓離心↓10000rpm，5min棄上清液↓4ml無(wú)菌生理鹽水↓玻璃珠振蕩↓20~30min單細(xì)胞菌懸液→平板菌落計(jì)數(shù)↓UV誘變平板菌落計(jì)數(shù)Ⅱ.鏈霉素抗性突變株篩選以紫外線誘變獲得大腸桿菌鏈霉素抗性突變株為例，學(xué)習(xí)微生物誘變育種根本技術(shù)。菌種：大腸桿菌E.coli培育基：養(yǎng)分肉湯、養(yǎng)分瓊脂、養(yǎng)分瓊脂+Str、生理鹽水等2mg/ml；終濃度8g/ml儀器：紫外誘變箱、超凈工作臺(tái)、紅燈、鐵筒、離心機(jī)、混合儀等鏈霉素屬氮基糖昔類抗生素。細(xì)菌對(duì)氨基糖昔類抗生素產(chǎn)生耐藥性作用機(jī)理重要有如下幾種:其一，細(xì)菌產(chǎn)生相應(yīng)鈍化酶對(duì)進(jìn)人胞內(nèi)活性分子進(jìn)展修飾，令其失去生物活性；S12rpsL基因或其他基因發(fā)生突變導(dǎo)致核糖體或核糖體蛋自發(fā)生變化而產(chǎn)生。動(dòng)身菌株轉(zhuǎn)接養(yǎng)分肉湯斜面活化；菌株培育、細(xì)胞收集和離心、紫外誘變解決同試驗(yàn)二；0.5ml+Str平板〔Str終濃度g/m，培育后記錄抗性菌落數(shù)，計(jì)算該菌自發(fā)突變率；1ml誘變解決好菌懸液接入液體養(yǎng)分肉湯液體培育基進(jìn)展后培育，37℃120rpm搖瓶培育；對(duì)后培育后來(lái)菌懸液進(jìn)展平板菌落計(jì)數(shù)和抗性菌落數(shù)計(jì)數(shù)，觀測(cè)紫外誘變效果。用紫外線對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)展誘變解決；運(yùn)用藥物平板篩選抗性突變株；觀測(cè)紫外誘變成果；計(jì)算大腸桿菌鏈霉素抗性突變率；自發(fā)突變率誘變前樣品中Str抗性菌數(shù)100%誘變前活菌數(shù)后培育以