實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)實(shí)用工具mir引物

目錄

1、序列的

2、引物的設(shè)計(jì)及篩選

3、miRNA序列的

4、miRNA引物設(shè)計(jì)

序列的

NCBI：

qRT-PCR引物 cds（codingsequence）序列

mRNA=5'UTR+cds(編碼蛋白）+3'UTR

引物設(shè)計(jì)原則

1.盡量不含發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體、錯(cuò)配；

2.引物GC含量在40%~60%之間；

3.sense和anti-sense的Tm比較接近；

4.按照Rating評(píng)分由高到低選擇（引物可自行編輯）。

miRNA序列

1.miRBase數(shù)據(jù)庫：

2. 相應(yīng)物種miRNA的成熟序列

插播內(nèi)容：miRNA-5p與3p的認(rèn)識(shí)

以hsa-miR-21為例：

hsa-miR-21-5p是指從hsa-mir-21前體的5’端臂加工而來，

hsa-miR-21-3p是指從hsa-mir-21前體的3’端臂加工而來；

表達(dá)水平較高的miRNA后面不加任何符號(hào)，而表達(dá)水平較低的miRNA后面加上*號(hào)，如hsa-miR-21*。有時(shí)帶“*”的miRNA就根本不出現(xiàn)。

miRNA引物設(shè)計(jì)

1. miRprimer2軟件使用

（見軟件說明書）

2. 自己動(dòng)手miRNA引物設(shè)計(jì)

自己動(dòng)手miRNA引物設(shè)計(jì)-反轉(zhuǎn)錄引物

以hsa-miR-26a為例

成熟序列：UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU

頸環(huán)序列:

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGGAC-3'

1.將U全部改成T

TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT

2.后面的6個(gè)堿基反響互補(bǔ)后加到頸環(huán)序列3'端

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGGAC

AGCCTA-3'

自己動(dòng)手miRNA引物設(shè)計(jì)-qRT-PCR引物

miRNA引物設(shè)計(jì)（莖環(huán)法+法檢測(cè)）

設(shè)計(jì)方法：通用莖環(huán)后端加miRNA后面6個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列為反轉(zhuǎn)錄引物，正向引物為miRNA去除后面6個(gè)堿基的序列，反向引物在莖環(huán)上。

反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)通用序列：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGGAC

miRNA序列：

>mmu-miR-99b-5p

MIMAT MusmusculusmiR-99b-5p

CACCCGUAGAACCGACCUUGCG

mmu-miR-99b-5p反轉(zhuǎn)錄頸環(huán)引物為：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGGACCG