生物素親和素

生物素親和素第1頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一概述生物素－親合素系統(tǒng)（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末發(fā)展起來的一種以生物素和親合素的特異結合反應為原理的新型生物反應放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于分子生物學各領域之中。1979年Guesdon利用生物素和親合素間具有高度親合力的特點，建立了標記親合素和生物素法與橋聯(lián)親合素—生物素技術。1981年Hsu首次報告了改進的親合素—生物素—過氧化酶復合物法（ABC法）。近年大量研究證實，生物素—親合素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合，如酶、熒光素、同位素、凝集素、鐵蛋白、核酸等。生物素—親合素已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。第2頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一一)生物素二)活化生物素與標記三)親和素及鏈霉親和素四)親和素及鏈霉親和素的標記五)生物素-親和素系統(tǒng)六)生物素-親和素系統(tǒng)的應用第3頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一第一部分

生物素第4頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一功能：可與多種標記物如酶、熒光素、同位素、凝集素、鐵蛋白、核酸等結合。這些生物活性物質在生物素化后，其活性不會受到顯著影響。如抗體分子經生物素化后，其結合抗原的活性不受影響。同樣多種酶結生物素化，其催化力也保持不變或稍有降低。概念：生物素(biotin)是動、植物體內廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H。生物素第5頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一與親合素結合與抗體或酶結合分子式：C10H16O3N2S

分子量：244.31等電點：PH=3.5溶解特性：難溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)兩個環(huán)狀結構：

I環(huán)（咪唑酮環(huán)）為與親和素結合的主要部位；

II環(huán)（噻吩環(huán)）為結合抗體和其它生物大分子的部位，C2上戊酸側鏈的未端羧基是結合生物大分子的唯一結構生物素第6頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一結構特點：咪唑酮環(huán)/四氫噻吩環(huán)結合親和素側鏈末端羧基結合蛋白質特性：羧基需經活化修飾才能結合蛋白質（羧基活化的生物素稱活化生物素或生物素衍生物）I咪唑酮環(huán)

Ⅱ噻吩環(huán)

羧基生物素第7頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一生物素的特點：1）生物素分子較小，與蛋白質結合后，由于大分子蛋白質的空間位阻效應，可影響生物素與親和素間的結合；2）生物素只能依靠肽鍵與蛋白質上的氨基結合。

活化生物素可克服以上缺點，既減少空間位阻效應，又可擴大其結合的對象。生物素第8頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一第二部分

活化生物素與標記第9頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一生物素側鏈的末端羧基經化學修飾后制成帶各種活性基團的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)活化生物素第10頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中相應基團偶聯(lián)形成生物素化標記物標記蛋白質氨基的活化生物素N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）長臂活化生物素（BCNHS）

標記蛋白質醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）標記蛋白質巰基的活化生物素3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）標記核酸的活化生物素光生物素、BNHS和BHZ生物素脫氧核苷三磷酸活化生物素第11頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一適合于Ab、酶、中性或偏堿性Ag、DNA、蛋白的標記標記蛋白質氨基的活化生物素第12頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一標記蛋白質氨基的活化生物素長臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個6-氨基已糖分子基團，形成連結臂，生物素與大分子基團的距離增加，更易發(fā)揮生物素的活性作用。如何減小空間位阻生物素分子量小，當與抗體或酶形成生物素標記結合物后，由于大分子蛋白的空間位阻效應，可對生物素與親和素的結合以及BAS的應用效果造成干擾。如何減小空間位阻？第13頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一標記蛋白質氨基的活化生物素標記特點：BNHS和BCNGS中的羧基與蛋白質中的賴氨酸氨基結合達到標記的目的BNHS分子可與蛋白質賴氨酸的氨基形成肽鍵BNHS適用標記抗體和中性或偏堿性的蛋白質第14頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一標記蛋白質醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)

：生物素與賴氨酸連接后，再與無水肼反應而成。除醛基外，BCHZ還可標記氨基第15頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一標記特點：BHZ與蛋白質中的醛基結合而標記標記蛋白質醛基的活化生物素第16頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一標記蛋白質巰基的活化生物素馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特異地與蛋白質巰基結合的活化生物素第17頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一標記核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)光敏物質側鏈上連接的芳香基疊氮物基團，經光照后，變?yōu)榉枷慊趸?，可直接與腺嘌呤氨基結合，形成B-核酸探針，用于DNA或RNA的標記。目前常用光生物素和生物素化dUTP作為標記核酸的活化生物素。N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO第18頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）

作為TTP的結構類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。標記核酸的活化生物素BNHS和BHZ

可直接標記核酸，但對堿基配對有影響（影響氫鍵的形成）第19頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一特性：活化生物素通過側鏈與蛋白分子連接；一個蛋白分子可被多個生物素標記－多價性（是BAS多級放大作用的物質基礎）；BNHS多標記抗體和中性或偏堿性的蛋白質,BHZ則多標記微酸性抗原；抗原、抗體標記后活性不變；可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后，活性降低；活化生物素標記蛋白質第20頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一注意事項：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記基團的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1，IgG應用濃度0.5~5μg/ml；生物素1~3個/Ag，3~5個/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力活化生物素標記蛋白質第21頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一第三部分

親和素和鏈霉親和素第22頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一親和素概念：是動物微生物中提取的一種含10%碳水化物的堿性糖蛋白，可由蛋清中提取。親和素可以和4個生物素分子親密結合，這雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩(wěn)定。且由于多種生物活性物質在生物素化后，其活性不會受到顯著影響，故而二者在結合反應時具有的多級放大作用。主要包括：卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素等。后兩種因其特異性親合力低，研究不多，前兩種目前已深入研究并得到廣泛應用。結構：4個相同亞基組成的四聚體糖蛋白，富含色氨酸，它是與生物素結合的基團。特性：每個亞基都可結合1個生物素分子，即1個親和素分子可結合4個生物素分子。第23頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一分子量：68000親和常數(shù)：1015/mol缺點：由于是堿性蛋白（PI=10），且含糖基，與聚苯乙烯的非特異性吸附較高，會導致本底增大，降低檢測靈敏度。親和素溶于水：C=5mg/ml；比活性：A≥12u/mgP第24頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一概念：是從鏈球菌屬的菌培養(yǎng)液中提取的一種蛋白質。優(yōu)點：為弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此與聚苯乙稀的非特異性吸附遠低于親和素，因此應用廣泛。結構：由4個相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸含量較大。特性：1個親和素分子可結合4個生物素分子。鏈霉親和素分子量：65000親和常數(shù)：1015/mol第25頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一結構

四亞基糖蛋白

四肽鏈蛋白無糖基PI10.5

6結合位色氨酸

色氨酸生物素

44Ka

10151015活性

13～15U15～18U親合素（AV）鏈霉親合素(SA)SA表面所帶正電荷少，且不含糖基，非特異性結合遠低于AV，因此目前以SA標記的酶結合物更為常用。親和素和鏈霉親和素第26頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一親合素(Avidin,AV)親和素（Avidin)耐熱并耐受多種蛋白水解酶的作用，與生物素結合后穩(wěn)定性更好。每個親和素能結合四個分子的生物素生物素（Biotin,B）第27頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一第28頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一第四部分

親和素和鏈霉親和素的標記第29頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一親和素的標記：HRP(過氧化酶)的標記標記物：小分子物質：示蹤物125I、膠體金、異硫氰酸熒光素(FITC)、化學發(fā)光物大分子物質：如酶、抗原、抗體、鐵蛋白

親和素和鏈霉親和素的標記改良過碘酸鈉法戊二醛法鏈霉親和素的標記方法：過碘酸鈉法HRP+NaIO4+SA透析+KBH4

沉淀第30頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一親和素標記-過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4+NH2AvidinOOOHOHNAvidinH2OOOOHOOONAvidinNAvdinNaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)第31頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一親和素標記-戊二醛法酶－NH2親和素－NH2＋(CH2)3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN親和素第32頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一鏈霉親和素標記-過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOH+NH2SAvidinNSAvidinH2OOOOHOOONSAvidinNAvdinKBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)第33頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一第五部分

生物素-親合素系統(tǒng)第34頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一生物素-親合素系統(tǒng)生物素與親合素之間結合的親合力高、特異性強生物素與親合素各自均可以與各型大小分子結合，以及二者在結合反應時具有的多級放大作用等優(yōu)越性使BAS及其相關技術被廣泛應用在各種標記免疫分析技術領域中，尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻

第35頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一靈敏度高:生物素標記蛋白具有多價性，且標記后的抗原/抗體生物活性不變，每個親合素有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合到生物素化大分子衍生物和標志物上，因此，BAS具有多級放大作用，反應的靈敏度高。穩(wěn)定性高和特異性強：AV/SA與生物素結合的親和常數(shù)比抗原-抗體反應至少高1萬倍，二者的結合呈高度專一性和不可逆性，且酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶、有機溶劑以及反應試劑的高度稀釋均不影響其結合。因此，BAS穩(wěn)定性高，特異性強。生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點第36頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一適用性廣泛：BAS的多級放大作用，以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標記材料，使BAS不僅用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質用于上述各類反應體系中反應物的分離、純化。其他：可制成通用試劑（如生物素化二抗等）；反應試劑可高度稀釋，特別是與一抗偶聯(lián)使用可大幅減少一抗用量，降低實驗成本；實驗所需時間不長。生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點第37頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BAS的基本類型及原理

可有Ag與Ab反應的各種免疫方法：夾心法、間接法、競爭法等，在此基礎上引入A-B系統(tǒng)。BAB法：BA法：ABC法：第38頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BAB法（親和素-標記生物素法）：特點：以游離親和素為橋臂，分別連接生物素化抗原（或抗體）和標記生物素（如酶標生物素）

BAS的基本類型及原理-BAB法第39頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E+A+A親和素-標記生物素法（BAB法）：先使抗原與生物素（B）化的抗體結合，再以游離親合素(A)將生物素化的抗體與酶標生物素搭橋連接，也達到多層放大效果。親合素(A)生物素化的抗體酶標生物素底物BAS的基本類型及原理-BAB法第40頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BAS的基本類型及原理-BA法BA法（標記親和素-生物素法）特點：以標記親和素/標記鏈霉親和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的游離親和素（A），省卻了加標記生物素（B-E）的步驟。第41頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一+A-E標記親和素-生物素法（BA法）：以標記親和素/標記鏈霉親和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的親和素（A），省卻了加標記生物素（B-E）的步驟。A-E+A-EBAS的基本類型及原理-BA法

Ag+B·AbAg-Ab·BA·E/SA·EAg-Ab·B-A/SA·E第42頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BAS的基本類型及原理-ABC法ABC系統(tǒng)（親和素-生物素-過氧化物酶復合物系統(tǒng)）特點:將BAB法中的A（親和素）先與B-E（酶標生物素）結合，制備成復合物ABC（親和素-生物素-過氧化酶復合物），網(wǎng)絡了大量酶分子，使該法的檢測靈敏。度顯著提高。ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC第43頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一（1）ABC復合物的制備：生物素生物素-PO過氧化物酶（PO）親和素親和素-生物素-POBAS的基本類型及原理-ABC法第44頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一ABC法中過氧化物酶常用辣根過氧化物酶，通過它與底物的顯色程度來判斷抗體或抗原含量并對其進行標記。此法廣泛應用于免疫組織化學及酶聯(lián)免疫吸附等技術中生物素化的二抗一抗過氧化物酶底物顯色的反應混合物固定化抗原生BAS的基本類型及原理-ABC法（2）ABC法反應原理第45頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一+ABCAb-Ag-Ab-B

+

ABCAb-Ag-Ab-B-ABC預先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標生物素結合，形成可溶性的親和素（或鏈霉親和素）-生物素-過氧化物酶復合物（ABC或SABC）。當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時，ABC（或SABC）復合物中未飽和的親和素（或鏈霉親和素）結合部位即可與抗體上的生物素結合，使抗原-抗體反應體系與ABC（或SABC）標記體系連成一體進行檢測+BAS的基本類型及原理-ABC法第46頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一ABC法原理示意圖BAS的基本類型及原理-ABC法第47頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BABBAABCBAS的分類比較BAB與ABC成員相同，反應順序不同第48頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一此外，按待檢反應體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，BAS分為直接法和間接法。

方法

反應層次

直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-A-B*C

間接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS實驗方法及反應層次BAS的分類比較第49頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一第六部分

生物素-親合素系統(tǒng)的應用第50頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BAS在酶免疫技術中的應用BAS在熒光免疫技術中的應用BAS在放射免疫技術中的應用BAS在分子生物學中的應用生物素-親合素系統(tǒng)的應用第51頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BAS在酶免疫技術中的應用BAS在ELISA中的應用：生物素-親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測定BAB-ELISA夾心法測抗原的原理：用生物素化的抗體替代常規(guī)ELISA中的酶標抗體，與已與固相抗體結合的抗原抗體復合物結合，然后連接親和素及酶標生物素，從而使反應信號放大，提高檢測靈敏度BAS在ELISA中的應用：BAS用于固相化抗原/抗體的制備：AV/SA先包被固相載體、抗原/抗體先與生物素結合AV/SA-B反應而使抗原/抗體固相化。BAS用于ELISA的終反應放大：BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISABAS在均相酶免疫測定中的應用：

B·E*A-B·E（酶因活性中心受空間位阻作用而失活）反應系統(tǒng)：B·E*

、Ag·A、Ab（限量）、標準Ag/待檢AgAg·A和待檢Ag競爭結合限量Ab，若AgAg·AbAg·AAg·A-B·E酶活性變化與待測標本中抗原濃度呈負劑量相關。（酶活性降低）A第52頁，共60頁，2023年，2月20日，星期一BAS在酶免疫技術中的應用第53頁，共60頁，2023年