生物分開(kāi)工程復(fù)習(xí)筆記

本文格式為Word版，下載可任意編輯——生物分開(kāi)工程復(fù)習(xí)筆記生物分開(kāi)工程

內(nèi)容：

1.生物分開(kāi)工程概念、特點(diǎn)、操作流程等；

2.生物分開(kāi)中常用到的分開(kāi)操作方法，其概念、原理、特征、適用對(duì)象、本卷須知、優(yōu)缺點(diǎn)、使用實(shí)例等；3.常用方法的比較；

基本知識(shí)點(diǎn)（一）

一．生物分開(kāi)工程概述1，生物分開(kāi)工程（P1）

生物分開(kāi)工程是指從發(fā)酵液、反應(yīng)液或動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)液中分開(kāi)、純化生物產(chǎn)品的過(guò)程。它描述了生物產(chǎn)品分開(kāi)、純化過(guò)程的原理、方法和設(shè)備，又稱為生物工程下游技術(shù)。

特征：應(yīng)用面廣;種類繁多，結(jié)構(gòu)功能繁雜，生物活性各異;目的產(chǎn)物在初始物料中的含量低;原料中目標(biāo)產(chǎn)物濃度越低，所需能耗越高，分開(kāi)過(guò)程成本越大;始物料成分繁雜,常需多個(gè)步驟,產(chǎn)品總收率低;易變質(zhì)、易失活、易變性，對(duì)溫度、pH值、重金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感；產(chǎn)品的質(zhì)量要求高，特別是藥品等

2.傳統(tǒng)生化產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的差異（P1）（了解）

1）傳統(tǒng)生化產(chǎn)品都為小分子(工業(yè)用酶除外，但它們對(duì)純度要求不高、提取方法較簡(jiǎn)單)．其理化性能(如平衡關(guān)系等)數(shù)據(jù)都為已知，因此放大比較有根據(jù)；基因工程產(chǎn)品大多為大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)。

2）由于第一代基因工程產(chǎn)品都以E.coli作為宿主，表達(dá)產(chǎn)品處于胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)，給提取增加了好多困難；而發(fā)酵液中的產(chǎn)物，濃度較低，雜質(zhì)又多，且一般大分子較小分子不穩(wěn)定(易失活，如對(duì)剪切力)，故提取較困難。

3）大分子(蛋白質(zhì))的分開(kāi)主要困難在于雜蛋白的分開(kāi)，由于蛋白質(zhì)都內(nèi)氨基酸所構(gòu)成，所以性質(zhì)相像，分開(kāi)主要依靠高分辯力的精制方法，如色譜分開(kāi)等。

3.生物技術(shù)下游加工過(guò)程的一般流程和單元操作（P4）1）一般工藝流程

一般來(lái)說(shuō)，下游加工過(guò)程含培養(yǎng)液（發(fā)酵液）的預(yù)處理和固液分開(kāi)；初步純化（提取）；高度純化（精制）；最終純化。

第1頁(yè)共1頁(yè)

生物分開(kāi)工程

2）具體過(guò)程

1發(fā)酵液預(yù)處理和固液分開(kāi)○

過(guò)濾和離心是預(yù)處理最基本的單元操作。由于發(fā)酵液的粘度高，所以分開(kāi)之前要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，主要采用凝聚和絮凝等技術(shù)來(lái)加速固、液相分開(kāi)。在固液分開(kāi)的方法、設(shè)備上，除可用鼓式真空過(guò)濾機(jī)外，較好的方法是采用錯(cuò)流膜過(guò)濾技術(shù)——改變發(fā)酵液的性質(zhì)，以利于固液分開(kāi)。

2細(xì)胞破碎及其碎片的分開(kāi)○

細(xì)胞破碎方法：機(jī)械、生物、化學(xué)。大規(guī)模生產(chǎn)，高壓勻漿機(jī)（利用液相剪切力和固定表面撞擊所產(chǎn)生的應(yīng)力）和珠磨機(jī)（依靠研磨），二者機(jī)理不同，但可相互補(bǔ)充。

碎片分開(kāi)方法：一般為離心分開(kāi)，兩水相萃?。ㄐ路椒?，使細(xì)胞碎片集中分布在下相中）。3初步純化（提?。?/p>

主要是除去與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)有很大差異的物質(zhì)，一般會(huì)發(fā)生顯著的濃縮和產(chǎn)品質(zhì)量的增加。方法：吸附法、沉淀法、離子交換法、萃取法（溶劑萃取、兩水相萃取、超臨界流體萃取、逆膠束萃取等）、膜過(guò)濾法（超濾、微濾等）。4高度純化（精制）○

對(duì)產(chǎn)物有高度的選擇性。主要目的除去與被純化物有類似化學(xué)功能和物理性質(zhì)的不純物。色譜分開(kāi)(離子交換層析、凝膠層析、親和層析等)、電泳、結(jié)晶等。5最終純化○

產(chǎn)物的最終用途決定了產(chǎn)品最終的加工方法，常用的方法是濃縮、無(wú)菌過(guò)濾和去熱原、結(jié)晶、枯燥。（凝膠色譜法、高效液相色譜法，處理量少，一般應(yīng)用于最終純化）。

2.選擇純化方法的依據(jù)（P9）

目標(biāo)：高回收率、高產(chǎn)率、低成本

根據(jù)：目標(biāo)蛋白質(zhì)和咋蛋白質(zhì)在物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)的差異，特別是表面性質(zhì)的差異。（表面電荷密度（滴定曲線）、對(duì)一些配基的生物特異性、表面疏水性、表面金屬離子、糖含量、自由巰基數(shù)目、分子大小和形狀（相對(duì)分子量）、pH值和穩(wěn)定性）?；驹瓌t：盡可能簡(jiǎn)單、低耗、高效、快速；分開(kāi)步驟盡可能少，每步收率盡可能高（分開(kāi)步驟越多，回收率越低；分開(kāi)步驟多，設(shè)備投入大，人員物資消耗大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)）；避免一致原理的分開(kāi)技術(shù)屢屢重復(fù)出現(xiàn)；盡量減少新化合物進(jìn)入待分開(kāi)的溶液；合理的分

第2頁(yè)共2頁(yè)

生物分開(kāi)工程

離步驟次序（先低選擇性，后高選擇性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本）。

注：當(dāng)幾種方法連用的時(shí)候，最好以不同的分開(kāi)機(jī)制為基礎(chǔ)，經(jīng)前一種方法處理后的液體適合于后一種方法處理，不需要經(jīng)過(guò)脫鹽、濃縮等處理。另親和層析選擇性最強(qiáng)，不用于第一步（雜質(zhì)多，簡(jiǎn)單使得介質(zhì)污染，使用壽命降低，體積較大需要大量的介質(zhì)，成本高）。

3.非蛋白類雜質(zhì)的去除（P9）

DNA：主要依靠電荷差異分開(kāi)，有離子交換法、親和層析、疏水層析等

熱原質(zhì)（主要是腸桿菌科所產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素）：最好的方法是防止產(chǎn)生熱原質(zhì)。傳統(tǒng)的去熱原質(zhì)的方法不適合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，用超濾或反滲透的方法去熱原適用于小分子量的多肽或蛋白質(zhì)，對(duì)大分子蛋白質(zhì)無(wú)效。

病毒：經(jīng)過(guò)色層分開(kāi)（如離子交換層析）一般能夠?qū)⒉《救コ?，必要時(shí)可以采用紫外線照射或過(guò)濾使病毒失活或除去。

4.目標(biāo)蛋白質(zhì)的表征和分析方法（P10）

蛋白質(zhì)在分開(kāi)、純化過(guò)程個(gè)易發(fā)生變化，因此得到的產(chǎn)品應(yīng)與已知標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，證明為同一物質(zhì)并檢查其純度。為達(dá)此目的，僅用一種分析方法是不夠的，常需用幾種方法。HPLC選用基于個(gè)同原理的兩種層析系統(tǒng)(如反相層析和離子交換層析)，如只得到單個(gè)對(duì)稱峰則說(shuō)明純度較高；

聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦；

序列分析：N·端和C端順序分析可用來(lái)表征蛋白質(zhì)：

其他分析，如氨基酸分析、肽圖、免疫化學(xué)分析等可進(jìn)一步提供產(chǎn)品純度達(dá)到均質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)品一致的證明。

二．發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分開(kāi)方法（P13）1.發(fā)酵預(yù)處理概述

1）概念：以細(xì)胞培養(yǎng)液或發(fā)酵液為出發(fā)點(diǎn)，設(shè)法使目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中，同時(shí)除去其

它懸浮顆粒以及改善濾液性狀以利于后續(xù)操作的過(guò)程稱為發(fā)酵液的預(yù)處理。

2）策略：

胞外產(chǎn)物：應(yīng)盡可能轉(zhuǎn)移到液相中，常用調(diào)pH至酸性或堿性的方法來(lái)達(dá)到。胞內(nèi)產(chǎn)物：首先收集細(xì)胞、破壁，生化物質(zhì)釋放到液相，再分開(kāi)細(xì)胞碎片。尋常，以含生化物質(zhì)的液相為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)行后繼操作。

3）目標(biāo)：

改變發(fā)酵液中固體粒子的物理性質(zhì)，如降低溶液的粘度，增加固體粒子的大小等，促進(jìn)從懸浮液中分開(kāi)固形物的速度，實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的過(guò)濾。盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的相中（液相）。去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。

4）要求和方向：

菌體分開(kāi)；固體懸浮物的去除；蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除；重金屬離子的去除；色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)的去除；改變發(fā)酵液的性質(zhì)，便于后續(xù)的分開(kāi)提??；調(diào)理適合的pH和溫度。

發(fā)酵液雜質(zhì)：高價(jià)無(wú)機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）（采用離子交換提純時(shí)，會(huì)影響樹(shù)脂對(duì)

第3頁(yè)共3頁(yè)

生物分開(kāi)工程

目標(biāo)產(chǎn)物的交換容量），雜蛋白質(zhì)（離子交換法和大網(wǎng)格樹(shù)脂吸附法提取時(shí)，會(huì)降低吸附能力。

有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分開(kāi)不完全。常規(guī)過(guò)濾或膜過(guò)濾時(shí)，使濾速下降，膜受到污染）。

2.發(fā)酵液預(yù)處理方法

1）加熱法:降低發(fā)酵液粘度，注意控制溫度和時(shí)間。2）調(diào)理pH值和去除高價(jià)無(wú)機(jī)離子的方法：1為了改變發(fā)酵液的膠體狀態(tài)或使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相，○往往要調(diào)整它的pH值，一般用草酸酸化。

草酸溶解度小，用量大時(shí)，可用其鹽，如草酸鈉。草酸價(jià)格較貴，注意回收（四環(huán)類抗生素廢液中，參與硫酸鉛，在60℃下生成草酸鉛。后者在90-95℃下用硫酸分解經(jīng)過(guò)濾、冷卻、結(jié)晶后可回收草酸）。

2去除鈣離子：一般用草酸的鈉鹽生成草酸鈣↓，草酸鈣能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，提高濾液的○

質(zhì)量。

3去除鎂離子：參與三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成沉淀：用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣○

離子和鎂離子的濃度。此法可用于環(huán)絲氨酸的提煉。

4去除鐵離子：可參與黃血鹽，使形成普魯士藍(lán)沉淀（3K4Fe(CN)6＋4FeCl3→12KCl＋○

Fe4[Fe(CN)6]3↓）。

3）加水稀釋法4)參與助濾劑法

5)色素及其他雜質(zhì)的去除方法6)加吸附劑法或加鹽法7)可溶性雜蛋白的去除法

等電點(diǎn)沉淀：蛋白質(zhì)在堿性溶液里帶負(fù)電，在酸性溶液里帶正電，在等電點(diǎn)處得溶解度最小。

使雜蛋白質(zhì)變性熱變性法（變性蛋白質(zhì)的溶解度較小）：加熱，液體粘度降低，加快過(guò)濾速度；大幅度調(diào)理pH值，酸性條件下去除雜蛋白較多；加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等，只適合發(fā)酵液量少的場(chǎng)合。不足之處：加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法尋常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。

利用吸附作用沉淀蛋白質(zhì)；參與蛋白質(zhì)沉淀劑

8）凝聚（集）和絮凝技術(shù)

1凝聚作用是在某些電解質(zhì)作用下，如中性鹽作用下，使擴(kuò)散雙電層的排斥電位降概念：○

低，破壞膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過(guò)程。

2有機(jī)高分子聚合物絮凝劑通過(guò)靜電引力、范德華分子引力或氫鍵的作用，猛烈地吸附在○

膠粒的表面，一個(gè)高分子聚合物的大量鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生架橋聯(lián)接，生成粗大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。

3混凝是在料液中，先參與無(wú)機(jī)電解質(zhì)，使懸浮粒子間的相互排斥能降低，脫穩(wěn)而凝聚成○

微粒，而后再參與絮凝劑的操作過(guò)程。將絮凝和凝聚結(jié)合起來(lái)的過(guò)程。

4凝聚價(jià)：○使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度(mmol/L)，表示電解質(zhì)的凝聚能力，反

離子的價(jià)數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強(qiáng)。

膠粒能保持分散狀態(tài)的原因：

擴(kuò)散雙電層（ζ電位是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來(lái)表征雙電層的特征）的結(jié)構(gòu)：一旦由于布朗(Brown)運(yùn)動(dòng)使粒子間距離縮小到它們的擴(kuò)散層部分重疊時(shí)，即產(chǎn)生電排斥作

第4頁(yè)共4頁(yè)

生物分開(kāi)工程

用，阻止了粒子的聚集。ζ電位越大，電排斥作用就越強(qiáng)，膠粒的分散程度也越大。水化層：由于膠粒表面的水化作用，形成了水化層，也能阻礙直接聚集。水化膜主要是伴隨膠粒帶電而引起，一旦ζ電位降低或消失，水化層也會(huì)隨之減弱或消失。

絮凝作用：指在某些高分子絮凝劑存在下，在懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用，而使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程，它是一種以物理的集合為主的過(guò)程。優(yōu)點(diǎn)：采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分開(kāi)。不僅可以提高過(guò)濾速度，還能有效去除雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì)，如菌體、細(xì)胞和細(xì)胞碎片等，提高濾液質(zhì)量。

絮凝劑：無(wú)機(jī)絮凝劑（硫酸鋁、氯化鈣等和一些無(wú)機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽和聚合鐵

鹽等。）有機(jī)絮凝劑：主要有中性、陰性和陽(yáng)性絮凝劑，包括：自然高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物，海藻酸鈉，明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等）和人工合成的高分子絮凝劑（聚丙烯酰胺類、聚苯乙烯類、聚乙烯亞胺類）。微生物絮凝劑和自然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是安全，無(wú)毒和不污染環(huán)境。

凝聚和絮凝技術(shù)能有效地改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來(lái)，

增大體積，以便于過(guò)濾。常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理。

影響絮凝效果的因素：絮凝劑濃度；絮凝劑分子量；絮凝劑類型；溶液的pH；攪拌速度

和時(shí)間（參與絮凝劑初期應(yīng)高轉(zhuǎn)速，使絮凝劑快速均勻分散到料液中，不形成局部過(guò)濃，但接著應(yīng)當(dāng)?shù)退贁嚢?，利于絮凝體長(zhǎng)大成團(tuán)）；助凝劑

3.固液分開(kāi)（P18）

1）目的：○1收集含胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體，分開(kāi)除去液相；○2收集含生化物質(zhì)的液

相，分開(kāi)除去固體懸浮物。常用方法過(guò)濾和離心分開(kāi)。

2）影響固液分開(kāi)的因素

主要取決于細(xì)胞或菌體的大小、形狀及介質(zhì)的粘度。發(fā)酵液中懸浮粒子的大?。Ｗ釉叫。珠_(kāi)難度越大，費(fèi)用成本越高）；菌種；細(xì)胞培養(yǎng)液的粘度（培養(yǎng)條件、放罐時(shí)間、發(fā)酵染菌、發(fā)酵pH和溫度）。

3）過(guò)濾（P19）

概念：借助于過(guò)濾介質(zhì)，在一定的壓力差作用下，將懸浮液中的固體粒子截留，而與液體分開(kāi)的技術(shù)。

濾餅的質(zhì)量比阻rB：衡量過(guò)濾特性的主要指標(biāo)，表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)。

濾餅的比阻值是隨操作壓力差的提高而增大的。因此開(kāi)始過(guò)濾時(shí)應(yīng)注意不能很快提高壓差，尋?？恳褐淖匀粔翰钸M(jìn)料，并應(yīng)緩慢地逐步地升高壓力，一般在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，壓力差不要超過(guò)0.05MPa，最終的壓差(不包括榨濾)也不超過(guò)0.3一0.4MPa。

1板框式壓濾機(jī)，過(guò)濾面積大，過(guò)濾推動(dòng)力能夠大幅度進(jìn)行調(diào)整，耐受較高的過(guò)濾設(shè)備：○

壓力差，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，價(jià)格較低，動(dòng)力消耗少，但不能夠連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動(dòng)強(qiáng)度大，

2鼓式真空過(guò)濾機(jī)，能夠連續(xù)操作，并能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)衛(wèi)生條件差，非生產(chǎn)的輔助時(shí)間長(zhǎng)；○

化控制，但壓差較小，主要是用于霉菌發(fā)酵液的過(guò)濾。對(duì)菌體較細(xì)或粘稠的發(fā)酵液不太適用。對(duì)于放線菌發(fā)酵液的過(guò)濾可采用加一層助濾劑。

第5頁(yè)共5頁(yè)

生物分開(kāi)工程

定在交聯(lián)瓊脂糖凝膠中制得蛋白質(zhì)吸附劑，可以用來(lái)分開(kāi)分子量或電荷量十分接近的蛋白質(zhì)。如麥芽外源凝聚素（WGA，分子量36000）和琥珀酰麥芽外源凝聚素（Suc-WGA）的分開(kāi)。

8.凝膠層析法

1凝膠層析載體是多孔凝膠。當(dāng)溶質(zhì)通過(guò)層析柱時(shí)，分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能○

進(jìn)入凝膠顆粒的微孔里，只能隨溶劑一起移動(dòng)的，最先流出柱外；分子直徑比凝膠孔徑小的分子，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，延長(zhǎng)了路徑，向下移動(dòng)的速度落后于大分子。——操作便利，不會(huì)使物質(zhì)變性，層析介質(zhì)不需再生，可反復(fù)利用。用于脫鹽，生物大分子按分子大小分級(jí)分開(kāi)以及分子量測(cè)定。

2表示凝膠過(guò)濾介質(zhì)特征的參數(shù)○

排阻極限：不能擴(kuò)散到凝膠基質(zhì)內(nèi)部中去的最小分子的分子量；分級(jí)范圍：指出了當(dāng)溶液通過(guò)凝膠柱的時(shí)候，能夠?yàn)榻橘|(zhì)阻滯并且分開(kāi)的溶質(zhì)分子量范圍。吸水量：凝膠層析介質(zhì)使用前需要溶脹，溶脹后1g干凝膠所吸收的水分。（凝膠型號(hào)中的數(shù)字是吸水量乘以10）。凝膠顆粒大?。z顆粒一般為球形，可以用篩目表示，也可以用珠體直徑表示）。床體積：表示1g干凝膠在溶脹后所具有的最終體積。可用來(lái)估計(jì)凝膠裝柱后的床層體積?？障扼w積：表示填充柱中凝膠粒子周邊的總空間。

3凝膠層析操作：凝膠選擇（粗中者用于生產(chǎn)，細(xì)者用于科研和提純，極細(xì)者裝柱后簡(jiǎn)單○

堵塞，影響流速，不用于一般凝膠分開(kāi)）—裝柱（一般修長(zhǎng)柱）—上樣—洗脫（洗脫液成分應(yīng)當(dāng)與膨脹膠所用液體一致，一般操作壓力大，流速快，太大，凝膠會(huì)壓縮，流速很快減慢）—凝膠再生和保養(yǎng)

凝膠的前處理：溶脹（十倍蒸餾水）—堿洗（0.5NaOH）—酸洗（0.5HCL）—平衡（起始緩沖液）。

9.電泳法1）基本概念1電泳法：○靠溶質(zhì)在電場(chǎng)移動(dòng)中移動(dòng)速度不同而分開(kāi)的方法。溶質(zhì)要必需帶電，本身是離

子或是表面吸附離子而帶電。電泳中由于通電發(fā)熱等原因引起的對(duì)流，會(huì)使已經(jīng)分開(kāi)的溶質(zhì)重新混合，為防止對(duì)流，可將電泳在多孔介質(zhì)（為載體，多為凝膠）中進(jìn)行，稱區(qū)帶電泳。

2電滲：在電場(chǎng)中，液體對(duì)于一個(gè)固定固體的相対移動(dòng)。單位電場(chǎng)強(qiáng)度的電滲速度為電滲○

遷移率。對(duì)于陽(yáng)離子需將所測(cè)得的遷移率減去電滲遷移率，而陰離子則加上。

3凝膠電泳與凝膠過(guò)濾的區(qū)別：在凝膠電泳中樣品混合物中各分子的運(yùn)動(dòng)速度時(shí)小分○

子大于大分子，與凝膠過(guò)濾相反。在凝膠電泳中，系統(tǒng)里面沒(méi)有空隙體積，只有充滿整個(gè)凝膠連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在內(nèi)部大分子較小分子不簡(jiǎn)單移動(dòng)。

2）聚丙烯酰胺電泳

1聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），有兩種形○

式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)保持完整形態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及所帶的電荷量逐漸呈梯度分開(kāi)。

SDS蛋白質(zhì)（亞基）的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)（亞基）分子量的大小，分子形狀和電荷因素可以忽略。

2不連續(xù)電泳分為兩層，上層為濃縮膠，下層為分開(kāi)膠。濃縮膠的作用是堆積。濃縮膠濃○

度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。

第21頁(yè)共21頁(yè)

生物分開(kāi)工程

3蛋白質(zhì)以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分開(kāi)膠。由于SDS的結(jié)合，蛋白質(zhì)具有相像的形○

狀和電荷密度；由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以簡(jiǎn)單的通過(guò)凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中就會(huì)根據(jù)其各自分子量的大小而被分開(kāi)。因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。

七、結(jié)晶法1.基本概念

1）結(jié)晶：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學(xué)

成分均一，具有各種對(duì)稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點(diǎn)上呈規(guī)則的排列。2）適用范圍和特點(diǎn)：只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過(guò)程有良好的選擇性。通過(guò)結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會(huì)留在母液中，再通過(guò)過(guò)濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。結(jié)晶過(guò)程具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作便利，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素等產(chǎn)品的精制。

3）沉淀和結(jié)晶：固體有結(jié)晶和無(wú)定形兩種狀態(tài)。結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時(shí)

間進(jìn)行排列，粒子排列有規(guī)則—結(jié)晶；無(wú)定形固體：析出速度快，粒子排列無(wú)規(guī)則—沉淀。沉淀和結(jié)晶的過(guò)程本質(zhì)上一樣，都是新相形成的過(guò)程。

4）過(guò)飽和溶液及凱爾文公式

飽和溶液：當(dāng)溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時(shí)，該溶液稱為飽和溶液；過(guò)飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度時(shí)，該溶液稱之為過(guò)飽和溶液；

溶質(zhì)只有在過(guò)飽和溶液中才能析出；溶質(zhì)溶解度與溫度、溶質(zhì)分散度（晶體大?。┯嘘P(guān)。過(guò)飽和度：S=c/c*（過(guò)飽和程度尋常用過(guò)飽和溶液的濃度c與飽和溶液c'的比值表示）。

2.結(jié)晶（P184）

1）結(jié)晶過(guò)程：形成過(guò)飽和溶液（結(jié)晶的前提）—晶核形成—晶體生長(zhǎng)。過(guò)飽和度是結(jié)晶

的推動(dòng)力。

2）飽和曲線：

第22頁(yè)共22頁(yè)

生物分開(kāi)工程

3）過(guò)飽和溶液的形成（P184）：

1熱飽和溶液冷卻（等溶劑結(jié)晶），適用于溶解度隨溫度降低而顯著減小的體系。自然○

冷卻、間壁冷卻（冷卻劑與溶液隔開(kāi)）、直接接觸冷卻（在溶液