最佳呼吸機(jī)設(shè)置的生理和病理學(xué)基礎(chǔ)

最佳呼吸機(jī)設(shè)置的生理和病理學(xué)基礎(chǔ)第1頁/共42頁

為什么必須改變呼吸機(jī)設(shè)置的理念?第2頁/共42頁為什么需要肺復(fù)張治療?第3頁/共42頁死亡率變化趨勢(shì)第4頁/共42頁為什么需要改進(jìn)ALI和ARDS定義?第5頁/共42頁患者特征（ARDS定義）急性發(fā)作在不考慮PEEP水平的情況下PaO2/FiO2<200mmHg胸部正位X線或CT示雙側(cè)浸潤(rùn)PAWP<18mmHg或無左房高壓的臨床證據(jù)第6頁/共42頁2.1患者特點(diǎn)原理：為什么不完全接受ARDS的AECC定義？急性發(fā)作胸部正位X線或CT示雙側(cè)浸潤(rùn)PAWP<18mmHg或無左房高壓的臨床證據(jù)第7頁/共42頁第8頁/共42頁病毒載體非病毒載體引起免疫反應(yīng)容量小、制備困難無靶向性裸DNA直接注射磷酸鈣共沉淀脂質(zhì)體設(shè)備昂貴不適合大量細(xì)胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染率低已很少使用細(xì)胞毒性抑制外源基因的表達(dá)致DNA失活納米材料第9頁/共42頁殼聚糖的研究現(xiàn)狀體外轉(zhuǎn)染安全高效大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明半乳糖基化殼聚糖有肝靶向性大型動(dòng)物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)尚無文獻(xiàn)報(bào)道研究背景第10頁/共42頁三、研究?jī)?nèi)容研究?jī)?nèi)容大量提取純化質(zhì)粒chitosan納米微囊體外轉(zhuǎn)染7721細(xì)胞GdCl3iv體內(nèi)注射取主要臟器組織，檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)第11頁/共42頁第一部分研究?jī)?nèi)容殼聚糖－質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備第12頁/共42頁

實(shí)驗(yàn)方法質(zhì)粒的酶切鑒定研究?jī)?nèi)容圖2.pEGFP-N1質(zhì)粒圖譜，下方為MCR第13頁/共42頁研究?jī)?nèi)容圖3.pBIND質(zhì)粒圖譜，右側(cè)為其MCR第14頁/共42頁研究?jī)?nèi)容質(zhì)粒的大量提取與純化

QiagenTM

Endo-Free

plasmid

GigaKits

無內(nèi)毒素純度≥2×氯化銫梯度抽提

第15頁/共42頁殼聚糖－DNA復(fù)合物（納米微囊）的制備研究?jī)?nèi)容質(zhì)粒DNA50mmol/LNa2SO4＋0.02％chitosanVertex(2500rpm)30s第16頁/共42頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果研究?jī)?nèi)容12M圖4.質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖。1為pBIND，2為pEGFP-N1，M為DNA100bpladderMarker67bp34bp第17頁/共42頁研究?jī)?nèi)容M1234圖5.納米微囊及質(zhì)粒DNA電泳圖。M為marker，

1、3分別為pEGFP-N1，pBIND質(zhì)粒DNA，2、4分別為含pEGFP-N1/pBIND的納米微囊

第18頁/共42頁殼聚糖－DNA在7721肝癌細(xì)胞中的表達(dá)研究?jī)?nèi)容第二部分第19頁/共42頁實(shí)驗(yàn)方法研究?jī)?nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞爬片制作SMMC-7721細(xì)胞0.25％胰酶消化，加1-2滴至12孔板中的蓋玻片上，37℃孵箱放置1h，使細(xì)胞貼壁第20頁/共42頁研究?jī)?nèi)容用殼聚糖－質(zhì)粒（pEGFP-N1）納米微囊轉(zhuǎn)染，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000包裹相同的質(zhì)粒作為陽性對(duì)照轉(zhuǎn)染第21頁/共42頁檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)情況DAPI溶液染色熒光顯微鏡下觀察在同一視野下，分別計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞數(shù)和DAPI染色的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染率研究?jī)?nèi)容第22頁/共42頁統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：

所得數(shù)據(jù)處理用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義研究?jī)?nèi)容第23頁/共42頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6.7721細(xì)胞中GFP的表達(dá)×200 圖7.7721細(xì)胞DAPI染色×200研究?jī)?nèi)容第24頁/共42頁表1

殼聚糖組和脂質(zhì)體組的轉(zhuǎn)染率（％）殼聚糖組脂質(zhì)體組58.354.760.4±2.2*55.6±1.6分組視野2轉(zhuǎn)染率值*p<0.05vs脂質(zhì)體組

±S研究?jī)?nèi)容視野3視野162.860.257.554.6第25頁/共42頁討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示殼聚糖體外轉(zhuǎn)染的效率略高于轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體，說明殼聚糖是一種有效的體外轉(zhuǎn)染材料,為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容第26頁/共42頁殼聚糖肝靶向性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容第三部分第27頁/共42頁

實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

研究?jī)?nèi)容雜種犬6只，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心隨機(jī)分為2組實(shí)驗(yàn)組注射殼聚糖－質(zhì)粒納米微囊對(duì)照組僅注射裸質(zhì)粒第28頁/共42頁術(shù)前準(zhǔn)備

研究?jī)?nèi)容手術(shù)前1d靜脈注射氯化釓，清除Kupffer細(xì)胞

第29頁/共42頁研究?jī)?nèi)容圖8.動(dòng)物手術(shù)示意圖第30頁/共42頁圖9.動(dòng)物手術(shù)圖示，A為解剖肝門部，B為注射殼聚糖-DNA復(fù)合物研究?jī)?nèi)容AB第31頁/共42頁研究?jī)?nèi)容48h后處死動(dòng)物，取肝、心、脾、肺、腎組織，作冰凍切片滴少許甘油－碳酸鹽緩沖液，放置蓋玻片。置于熒光顯微鏡下，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況第32頁/共42頁研究?jī)?nèi)容實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖10.肝組織中GFP的表達(dá)，可觀察到黃綠色熒光×200第33頁/共42頁A.心B.肺D.脾C.腎圖11.其他組織無陽性熒光表達(dá)×200

第34頁/共42頁殼聚糖（chitosan）的優(yōu)點(diǎn)資源豐富生物可降解性無免疫原性靶向性保護(hù)DNA免受DNase的降解研究?jī)?nèi)容討論第35頁/共42頁圖12.殼聚糖具有肝靶向性的原理示意圖研究?jī)?nèi)容第36頁/共42頁關(guān)于殼聚糖在大型動(dòng)物體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道殼聚糖通過納米微囊表面攜帶的正電荷與細(xì)胞膜上攜帶負(fù)電荷的糖蛋白及磷脂的相互作用引發(fā)細(xì)胞胞吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。而且，殼聚糖能包裹、濃縮DNA，使DNA免受DNase的降解研究?jī)?nèi)容第37頁/共42頁經(jīng)肝動(dòng)脈和門靜脈注射的給藥途徑，臨床上有可行性如果用適當(dāng)?shù)墓δ芑蛱鎿Q報(bào)告基因,預(yù)期相應(yīng)的基因也可以表達(dá),并可能達(dá)到一定的治療效果

研究?jī)?nèi)容第38頁/共42頁小結(jié)本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖與質(zhì)粒制備成納米微囊復(fù)合體，體外轉(zhuǎn)染7721細(xì)胞，結(jié)果表明殼聚糖有較高的體外轉(zhuǎn)染效率體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過肝動(dòng)脈、門靜脈聯(lián)合給藥，在肝檢測(cè)到較高的綠色熒光蛋白表達(dá)水平首次在大型動(dòng)物體內(nèi)完成殼聚糖介導(dǎo)的外源性基因表達(dá)小結(jié)第39頁/共42頁致謝衷心感謝我的導(dǎo)師竇科峰教授在學(xué)習(xí)生活過程中的照顧和教導(dǎo)感謝陳勇教授在實(shí)驗(yàn)過程中