第七章基因的定點(diǎn)誘變

第七章基因的定點(diǎn)誘變第1頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第十章DNA誘變第2頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。經(jīng)典的方法是根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)的方法鑒定相應(yīng)的基因。第3頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一傳統(tǒng)的誘變方式利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體射線（紫外線、X射線、γ射線等）化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS、亞硝基胍等）第4頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一不足：生物體的任何基因都可能發(fā)生突變，目的基因突變率較低，篩選困難即使獲得期望表型的突變體，無(wú)法保證突變確實(shí)發(fā)生在目的基因上在基因克隆和核酸測(cè)序技術(shù)發(fā)展之前，無(wú)法知道基因中突變的位置和性質(zhì)第5頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Directedevolution

（定向進(jìn)化或直接進(jìn)化）

對(duì)目的基因人為制造大量突變，然后按照特定的需要和目的，給予選擇壓力，反復(fù)誘變，循環(huán)篩選，將滿(mǎn)足要求的、適合特定目的的分子篩選出來(lái)，獲得滿(mǎn)足需要的性能改良的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)在試管中分子水平的模擬進(jìn)化。第6頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因直接進(jìn)化的步驟突變基因突變庫(kù)的建立篩選

基因突變庫(kù)的活體或離體篩選第7頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Keystepsofatypicaldirectedenzymeevolutionexperiment

第8頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一體外誘變是對(duì)克隆化的DNA進(jìn)行誘變處理，改變其核苷酸序列，獲得突變基因。研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，獲得所需功能的突變體蛋白質(zhì)主要方法有：隨機(jī)誘變，DNA體外重組，寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變，嵌套缺失第9頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)隨機(jī)誘變隨機(jī)的在克隆化DNA中引入堿基置換突變，引入位置和性質(zhì)均為隨機(jī)性的。包括：1.錯(cuò)誤摻入誘變（易錯(cuò)PCR)2.盒式誘變

3.增變菌株的誘變作用

4.化學(xué)誘變第10頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一隨機(jī)突變的策略：1.易錯(cuò)PCR（error-pronePCR）

在擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，通過(guò)改變PCR反應(yīng)的條件（如改變4種dNTP的比例、改變Mg2+的濃度等），在PCR過(guò)程中引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因的隨機(jī)突變第11頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第12頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.盒式誘變

Cassettemutagenesis

利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列

包括兩種方式：盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變第13頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一簡(jiǎn)單盒式取代誘變第14頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一混合寡核苷酸誘變用于取代的是含有隨機(jī)突變的混合雙聯(lián)寡核苷酸，可引入大量的隨機(jī)突變。在合成寡核苷酸片段時(shí)，需要帶限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，以便介導(dǎo)它們互為引物第15頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3增變菌株的誘變作用因?yàn)镈NA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。與校正和修復(fù)有關(guān)的基因突變后細(xì)胞內(nèi)基因突變頻率大大增加，這樣的菌株叫突變菌株。第16頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一流程：把攜帶待突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入增變菌株擴(kuò)增，------隨機(jī)突變體庫(kù)。把該庫(kù)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到正常宿主中，篩選鑒定突變體。第17頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亞硝基胍等）處理DNA片段，產(chǎn)生隨機(jī)突變體庫(kù)。第18頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一DNA體外重組依賴(lài)序列同源性的DNA體外重組，包括DNA洗牌(DNAshuffing)，交錯(cuò)延伸（StEP)，隨機(jī)引發(fā)重組（RPR).第19頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.DNAshuffling

（DNA重排或改組）

DNAshuffling

是指DNA分子的體外重組,是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組。通過(guò)改變單個(gè)基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能第20頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基本步驟:目的基因片段的準(zhǔn)備：根據(jù)不同的需要選擇一個(gè)基因或其片段，也可以是幾個(gè)序列上具有較高同源性的基因DNaseI酶切：將基因隨機(jī)切割成約50～100bp左右的小片段不加引物的PCR：在Taq酶的作用下將切割后的DNA重疊小片段重新連接起來(lái)，在這個(gè)過(guò)程中可能發(fā)生許多突變和重組加引物的PCR：加入目的基因片段兩端的引物,

使連接好的DNA得到擴(kuò)增，篩選正突變。第21頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因家族的改組第22頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一交錯(cuò)延伸重組圖10-5以?xún)蓚€(gè)以上的有一定同源性的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)交換模板機(jī)制實(shí)現(xiàn)DNA序列的重新組裝。不需要DNaseI切割DNA，簡(jiǎn)化了程序。第23頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一隨機(jī)引發(fā)重組圖10-6用一套隨機(jī)引物與模板配對(duì)延伸，產(chǎn)生不同位點(diǎn)的短DNA片段混合物（含有少量點(diǎn)突變），以這些短DNA片段為引物重新組裝成全長(zhǎng)基因。第24頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變

①基本原理：使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作為引物，啟動(dòng)單鏈DNA分子進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為了新合成DNA子鏈的一個(gè)組成部分，因此所產(chǎn)生出來(lái)的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列第25頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第26頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一作為誘變劑的寡核苷酸序列：人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除了所需的堿基突變外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ)錯(cuò)配堿基的位置應(yīng)設(shè)計(jì)在寡核苷酸分子的中央部位，每側(cè)至少10-15個(gè)堿基通常采用化學(xué)合成無(wú)回文，重復(fù)和自身互補(bǔ)序列第27頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一②基本步驟：將待突變的目的基因插入M13噬菌體載體，制備單鏈DNA將合成的寡核苷酸片段與單鏈模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互補(bǔ)的雙鏈DNA將雙鏈DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得突變基因突變體的篩選：寡核苷酸探針雜交篩選法第28頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第29頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一局限性：突變體子代頻率低退火時(shí)，有些單鏈模板DNA未與寡核苷酸配對(duì)細(xì)胞內(nèi)甲基介導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制會(huì)修復(fù)新合成鏈中的錯(cuò)配堿基第30頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細(xì)胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細(xì)胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置一、Kunkel法或稱(chēng)“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基1．背景知識(shí)第31頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一E.coli(dut-/ung-)

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個(gè)尿嘧啶堿基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmid第32頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一ssDNA制備載體第33頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一ssDNA制備載體單鏈?zhǔn)删w載體phagemid載體第34頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突變鏈能復(fù)制轉(zhuǎn)化E.coliMV1190(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵圖10-7第35頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、AlteredSites?IIinvitromutagenesissystem位點(diǎn)選擇定點(diǎn)誘變法

第36頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第37頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、TransformerSite-Directedmutagenesis轉(zhuǎn)化子誘變法

第38頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一SynthesizesecondstrandDigestDNA(primarydigestion)TransformE.coli

mutS

topropagateplasmidsIsolateanddigest(Seconddigestion)TransformE.coliIsolateDNA第39頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第40頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、PCR定點(diǎn)誘變1.大引物PCR誘變圖10-10第41頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.重疊延伸Overlapextension對(duì)于兩個(gè)具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性后，兩個(gè)DNA片段之間通過(guò)同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈第42頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3、SOE重疊延伸剪接術(shù)

Splicingbyoverlapextension可用于將兩個(gè)DNA片段在所期望的位點(diǎn)進(jìn)行連接設(shè)計(jì)一個(gè)寡聚體引物，其序列包含兩個(gè)部分，“引發(fā)”和“重疊”部分，引發(fā)部分在3‘末端，起引物作用；重疊部分在5’末端，與待融合的DNA片段序列互補(bǔ)。設(shè)計(jì)另一個(gè)引物，該引物與上一個(gè)引物完全互補(bǔ)第43頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一ATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重疊延伸PCRAB第44頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化ExonucleaseIII5‘3‘5‘3‘5‘3‘第45頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第46頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.BAL31的消化主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3’端去掉除單核苷酸，還是一個(gè)內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)

依賴(lài)鈣離子EGTA可抑制活性第47頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一AABAdigestionvectorinsertBAL31BdigestionDeletedinsertsclonedtoplasmidvector第48頁(yè)，共51頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3.DNaseI的消化內(nèi)切酶，