第三章基因工程載體

第三章基因工程載體第1頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一定義：在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體。1.載體

（Vectors）多克隆位點(multiplecloningsite)ori復(fù)制起始點遺傳標(biāo)記pUCMCSAmpr第2頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（1）在宿主細胞內(nèi)能獨立復(fù)制，ori。（3）多克隆位點：外源基因插入的單一限制酶位點。2.基因工程對載體的要求（7）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。

（2）有選擇性標(biāo)記Ampr、Tetr、Kanr等。（4）分子量小，可容納較大的外源基因片段。（5）拷貝數(shù)多，方便外源基因在細胞內(nèi)大量擴增。（6）具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性。第3頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一載體的種類

基因工程中常用的載體有5類：

質(zhì)粒（plasmid）

單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（cosmid）

動物病毒（virus）

第4頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)

質(zhì)粒載體

一、質(zhì)粒（plasmid）獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子（CovalentlyClosedCircularDNA,ccc

DNA）。并不是細胞生長所必需的，但可以賦予細胞某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力，如抗生素抗性、對重金屬離子的抗性、分泌細菌毒素等。分子量在1-500kb之間廣泛存在于細菌。第5頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第6頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一5.根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1、質(zhì)粒構(gòu)建基本策略1.加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個以上，易于選擇轉(zhuǎn)化體2.增加或減少合適的酶切位點，便于重組3.縮短長度，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量4.改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝第7頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第8頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一1.pBR322：p:質(zhì)粒；BR：質(zhì)粒兩位主要構(gòu)建者姓氏的第一個字母；322：實驗編號人工構(gòu)建載體三個親本質(zhì)粒：pMB1:出發(fā)質(zhì)粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101四、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體第9頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個單一克隆位點。9個導(dǎo)致Tetr基因失活3個會導(dǎo)致Ampr基因失活第10頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一氯霉素擴增之后，每個細胞可達1000~3000copies③

安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。②高拷貝數(shù)

①

分子小，克隆能力大長度4363bp，易于純化，可以攜帶6-8Kb的外源DNA片段。④具有較多的單一酶切位點（24種）第11頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一4、pUC質(zhì)粒載體1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的結(jié)構(gòu)：（1）來自于pBR322的Ori（2）氨芐青霉素的抗性基因(ampr)。

但核苷酸序列發(fā)生了變化（3）LacZ′基因

編碼β—半乳糖酶的α—肽鏈（4）MCS區(qū)段

（MCS）區(qū)段位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點。但它并不破壞該基因的功能。第12頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一與pBR322相比，pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點：（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)

如pUC8為2750bp，pUCl8為2686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個細胞即可達500～700個拷貝（2）適用于組織化學(xué)法檢測重組體

通過-互補作用，利用菌落顏色篩選重組子。而pBR322質(zhì)粒的重組子要進行兩步的選擇。

（3）具有多克隆位點區(qū)段（MCS）

適合不同粘性末端的DNA片段插入，不必連接接頭

第13頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

釋放出的藍色物質(zhì)可以將整個菌落染成藍色，非常容易辨別，如果LacZ’插入外源基因被破壞，菌落則是白色的

。組織化學(xué)法檢測重組體X-Gal-半乳糖苷酶IPTG誘導(dǎo)物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷

半乳糖

5-溴-4-氯-靛藍＋第14頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第15頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)噬菌體載體組成：蛋白質(zhì)、核酸.結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼、尾巴尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內(nèi)。是比細菌還小得多的微生物，噬菌體侵犯細菌，可以認(rèn)為它是細菌里的“寄生蟲”。Bacteriophage(phage)第16頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一一、大腸桿菌的λ-噬菌體DNA（1）線狀雙鏈DNA，兩端各有一個12bp的互補單鏈（粘性末端，cohesive-endsite），稱λcossite，粘性末端粘連接變成環(huán)狀DNA。（一）λ-噬菌體的生物學(xué)特性1、由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成λcos位點是噬菌體包裝必需序列。

2、λ-DNA的物理圖譜48.5kb第17頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（2）功能相近的基因在基因組中聚集在一起

目前已經(jīng)被確定的基因至少61種，一半為必需基因第18頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（二）λ噬菌體載體的構(gòu)建1.選用λ噬菌體作為構(gòu)建克隆載體材料的依據(jù)是一種溫和噬菌體。能承載比較大的外源DNA片段λDNA分子上有多種限制酶的識別位點2.構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的技術(shù)路線用限制酶切去λDNA上的非必需區(qū)在λDNA上非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因建立λDNA分子體外包裝系統(tǒng)第19頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第20頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

（1）插入式載體只具有一個可供外源DNA插入的限制酶位點的λ噬菌體。常用：λgt10、λNM1149等載體.（2）置換型載體（取代型載體）具有成對的限制酶位點，在這兩個位點之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。

常用：EMBL3、EMBL4二.λ噬菌體載體的主要類型第21頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一三、λ-DNA作為載體的優(yōu)點可在體外包裝成噬菌體顆粒，高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量重組。λ-DNA分子的篩選較為方便。

λ-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，常用于構(gòu)建基因文庫缺點：(1)需要包裝比較麻煩，包裝率又不穩(wěn)定，購買包裝蛋白的費用又高；(2)沒有質(zhì)粒的用途廣泛。第22頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)、人工染色體克隆載體

基本元件：含有質(zhì)?？寺≥d體所必需的第一受體（大腸桿菌）的質(zhì)粒復(fù)制起始點；第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點、端粒和復(fù)制起始點的序列.合適的選擇標(biāo)記基因。

利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體。酵母人工染色體（YAC）細菌人工染色體（BAC）第23頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（一）酵母人工染色體（YAC）

把酵母染色體與基因復(fù)制和表達有關(guān)的主要組件都組裝在質(zhì)粒上，令質(zhì)粒行使酵母chr的轉(zhuǎn)錄功能和復(fù)制功能。

裝載量為350-400kb含有的元件：酵母自主復(fù)制序列(ARS)著絲粒序列(cen)四膜蟲端粒（tel）質(zhì)粒選擇標(biāo)記酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記質(zhì)粒復(fù)制起點第24頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一一、YAC的基本序列元件酵母染色體DNA自主復(fù)制序列（ARS）酵母染色體的著絲粒序列（CEN）酵母染色體的端粒序列（TEL）酵母人工染色體（YAC）YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。

第25頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一酵母自主復(fù)制序列（ARS)

一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進行雙向復(fù)制所必需的信號。

第26頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一酵母著絲點(CEN)在YAC中起到保證一個細胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。pYAC4：酵母第四條染色體的著絲粒。第27頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel）定位于染色體末端一段序列，用于保護線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。第28頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一二、

YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因TRP1：色氨酸生物合成基因缺陷型

URA3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型

LEU2：亮氨酸合成基因缺陷型

SUP

4：赭石突變抑制基因

第29頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一克隆位點：位于sup4基因內(nèi)SuP4是一個赭石突變（UAA）抑制基因。宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變ade2。在赭石突變宿主中，沒有外源基因插入時，sup4基因抑制赭石突變，則形成正常白色菌落；有外源基因插入時，sup4基因遭破壞，則形成紅色菌落，十分容易挑選出有DNA插入片段的紅色菌落，建成YAC文庫。第30頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一YAC克隆DNA片段的過程是：目的基因在限制性內(nèi)切酶酶解后變成大片段DNA，克隆進酵母載體DNA，轉(zhuǎn)染酵母縮主細胞，擴增后，根據(jù)標(biāo)記性狀篩選出重組的人工染色體。三、克隆策略第31頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一酵母人工染色體的使用第32頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一四、酵母人工染色體（YAC）缺點首先，在YAC載體的插入片段會出現(xiàn)缺失和基因重排的現(xiàn)象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個YAC中的插入片段由2個或多個的獨立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5%～50%。第三，YAC染色體與宿主細胞的染色體大小相近，就很難從中分離出來，影響了YAC載體的廣泛應(yīng)用。

第33頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（二）細菌人工染色體（BAC）

1992年Shizuya利用F因子的復(fù)制起點和氯霉素抗性標(biāo)記基因，在F質(zhì)粒（pMBO131）基礎(chǔ)上構(gòu)建了第一代BAC人工染色體。能夠克隆和保持大于100kb的DNA。用于：克隆大型基因簇結(jié)構(gòu)構(gòu)建動植物基因文庫第34頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

F因子的特點

又稱致育因子，是一個100kb的質(zhì)粒，能整合到宿主染色體中。并能高頻率的轉(zhuǎn)移遺傳標(biāo)記。F因子在大腸桿菌中的復(fù)制受到嚴(yán)格控制而保持低拷貝，一般為每細胞1～2個拷貝，其parB基因能夠排斥細胞中的外源性F質(zhì)粒，限制了細胞內(nèi)質(zhì)粒分子間的重排，降低了BAC中外源基因的重組和嵌合度第35頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一新一代BAC載體為7.4kb的環(huán)狀質(zhì)粒：F因子的parA，parB，parC基因以保證低拷貝的BAC質(zhì)粒在大腸桿菌分裂時均勻分配到子代細胞

oriS基因：來源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子第36頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一BAC優(yōu)點：

BAC載體容載能力一般為100-350kb

,雖然容量沒YAC

大，但BAC

具更多優(yōu)點：

1)以大腸桿菌為寄主,轉(zhuǎn)