植物組織培養(yǎng)實驗室

植物組織培養(yǎng)實驗室第1頁/共97頁目的與要求

了解植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基種類、成分及其特點，學習植物組織培養(yǎng)基本操作，了解離體培養(yǎng)環(huán)境條件，以及煉苗移栽基本方法。具有植物組織培養(yǎng)基本操作程序的認知。能夠識別各類培養(yǎng)基特點，熟悉MS培養(yǎng)基成分；具有制作培養(yǎng)基能力，具有選擇外植體、表面滅菌、無菌接種等基本能力；具有植物組織培養(yǎng)條件控制基本能力；有進行組培苗馴化練苗的基本能力。第2頁/共97頁第一節(jié)培養(yǎng)基成分、種類及特點第二節(jié)培養(yǎng)基的制備第三節(jié)外植體無菌接種第四節(jié)外植體培養(yǎng)第五節(jié)試管苗的馴化與移栽第3頁/共97頁第一節(jié)

培養(yǎng)基成分、種類及特點植物生長必需16種基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。離體培養(yǎng)條件下，各元素主要從培養(yǎng)基中獲得：H和O來源于水，C來源于添加的糖類，其它礦質元素來源于組成培養(yǎng)基的無機鹽。培養(yǎng)基是根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的人工制作的營養(yǎng)物質。第4頁/共97頁一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基一般包括無機鹽、有機化合物和生長調節(jié)劑三大基本組成成分。

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1、無機鹽類

功能:

離體組織生長發(fā)育的基本成分

根據(jù)植物對必需元素需要的量，可以分為以下兩類：

大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升幾十-幾千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。

微量元素—植物所需元素的濃度小于10-5～10-7mol/L，F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。除C、H、O外，其它礦質元素通常以離子態(tài)吸收N-硝態(tài)氮和銨態(tài)氮

第6頁/共97頁2、有機化合物

培養(yǎng)基中只有無機鹽叫做基本培養(yǎng)基，為使培養(yǎng)物更好的生長，還需添加有機成分，常用有糖類、維生素、醇類、嘌呤、氨基酸等。

⑴糖類功能離體培養(yǎng)物生長與發(fā)育不可缺少的有機成分，即作為碳源，又維持培養(yǎng)基的滲透壓在1.5-4.1MPa。

多使用蔗糖，試管苗生長與繁殖濃度2-3%，幼胚培養(yǎng)4-6%，某些特殊培養(yǎng)中用8-10%。細胞和原生質體培養(yǎng)還用麥芽糖、葡萄糖、果糖。第7頁/共97頁

⑵維生素類

功能參與酶的形成、蛋白質、脂肪代謝，明顯的促進離體培養(yǎng)物的生長。

鹽酸硫胺素-VB1、鹽酸吡哆醇-VB6、煙酸-Vpp、生物素-VH、維生素C-Vc。

⑶肌醇

功能促進糖的轉化、維生素和激素的利用，對胚狀體和芽的形成有良好影響。用量一般50-100mg/L。

第8頁/共97頁⑷腺嘌呤合成各種細胞分裂素的前體物質之一，利于細胞分裂，促進芽的形成和生長。

⑸氨基酸

蛋白質的成分，是有機氮化合物，常用甘氨酸和多種氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。

⑹其它復合成分

成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麥芽糖等。第9頁/共97頁3、生長調節(jié)物質

⑴生長素類功能促進細胞脫分化和細胞伸長，誘導愈傷組織產生生長素與細胞分裂素協(xié)調作用，在離體培養(yǎng)中，生長素促進根的形成，抑制芽的形成。液體培養(yǎng)中利于體細胞胚胎發(fā)生。

常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。IBA促進生根第10頁/共97頁細胞分裂素的生理效應⑵細胞分裂素類功能促進細胞分裂和擴大，調節(jié)器官分化，延緩組織衰老，增強蛋白質合成。離體培養(yǎng)中，促進不定芽的發(fā)生，與生長素協(xié)調作用可有效控制培養(yǎng)物的生長與分化。

常用6-BA、ZT、KT、2iP。

第11頁/共97頁植株的形態(tài)建成是CTK和IAA的比值調控的CTK/IAA高，誘導愈傷組織形成芽CTK/IAA低，誘導愈傷組織形成根第12頁/共97頁煙草在不同細胞分裂素與生長素濃度下的生理效應第13頁/共97頁⑶赤霉素類功能促進細胞伸長生長、誘導花芽形成、打破種子休眠以及誘導單性結實等。與生長素協(xié)調作用對形成層分化有影響，刺激體細胞胚進一步發(fā)育成植株。有20多種，目前主要是赤霉酸GA3。第14頁/共97頁4、水離體培養(yǎng)中，既是培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的溶劑，又是培養(yǎng)基的重要組成部分，占培養(yǎng)基成分的95%。原生質體培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般應用雙蒸水或超純水大批量快速繁殖培養(yǎng)，可用一般蒸餾水或純凈水。第15頁/共97頁5、其它附加成分⑴瓊脂

功能來自海藻的多糖類物質，組織培養(yǎng)中最常用作凝固劑，是最方便、最好的凝固劑和支持物。常用量0.6%-1.0%，不是培養(yǎng)基必需成分。

卡拉膠

海藻提取物，含雜質少純度更高，凝固后培養(yǎng)基透明，利于材料觀察。第16頁/共97頁⑵活性炭

功能常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附培養(yǎng)過程中產生的一些有毒物質（酚類物質），有利于培養(yǎng)物的生長。常用濃度1～5mg/L左右其吸附作用選擇性較差，使用應慎重。常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附能力降低甚至解吸附。第17頁/共97頁⑶抗生素培養(yǎng)基中添加抗生素可防止菌類污染，常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量一般為5～20mg/L。大部分抗生素需要過濾除菌。⑷抗氧化物抗酚類氧化常用的藥劑有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及抗壞血酸（Vc），可用50～200mg／L的濃度洗滌剛切割的外植體傷口表面，或過濾除菌后加入固體培養(yǎng)基的表層。第18頁/共97頁二、常用培養(yǎng)基的種類、配方及特點（一）培養(yǎng)基種類1、根據(jù)態(tài)相分：

固體培養(yǎng)基-加凝固劑的培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基-不加凝固劑的培養(yǎng)基。2、根據(jù)培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基-初次接種外植體的培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)基-接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。第19頁/共97頁3、根據(jù)作用分：

誘導培養(yǎng)基-誘導外植體啟動生長

增殖培養(yǎng)基-誘導離體培養(yǎng)苗擴大繁殖。

生根培養(yǎng)基-誘導離體培養(yǎng)苗生根4、根據(jù)營養(yǎng)水平分：

基本培養(yǎng)基-包含無機鹽等基本營養(yǎng)成分。

完全培養(yǎng)基-包含使植物離體生長全面營養(yǎng)。第20頁/共97頁（二）幾種常用培養(yǎng)基細胞工程常用的基本培養(yǎng)基有：MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。第21頁/共97頁（三）幾種常見培養(yǎng)基的特點1、富鹽平衡培養(yǎng)基無機鹽濃度高，元素比例適當，離子平衡好，具有較強的緩沖性，培養(yǎng)中維持較好的穩(wěn)定性，含高量氮、鉀，營養(yǎng)豐富，元素種類齊全，MS培養(yǎng)基使用最廣泛。第22頁/共97頁2、低鹽培養(yǎng)基無機鹽濃度低，有機成分含量低，多數(shù)作為生根培養(yǎng)基、胚胎培養(yǎng)使用，常用White培養(yǎng)基。3、高硝態(tài)鹽培養(yǎng)基

較低銨鹽，高硝酸鹽和鹽酸硫胺素B5培養(yǎng)基適合雙子葉植物特別是木本植物的生長。N6培養(yǎng)基為水稻等禾谷類花藥培養(yǎng)設計，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含鉬。SH培養(yǎng)基(NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,礦質濃度較高，多數(shù)單子葉和雙子葉植物上使用較好。

第23頁/共97頁4、中鹽培養(yǎng)基大量元素無機鹽為MS的1/2，微量元素種類減少含量增高，無肌醇維生素種類多，增加生物素、葉酸，有H、Hitsch、Miller、Blaydes等培養(yǎng)基，適用于特殊細胞培養(yǎng)。第24頁/共97頁第二節(jié)培養(yǎng)基的制備

制作一升培養(yǎng)基所需藥品20多種，為節(jié)省時間和配制的準確，需將各種藥品濃縮成一定倍數(shù)，并且混合成一定母液，進行保存。制作培養(yǎng)基時根據(jù)需求制培養(yǎng)基數(shù)量取用母液。第25頁/共97頁一、培養(yǎng)基母液的配制

（一）營養(yǎng)成分的配制根據(jù)藥品性質將母液配制成以下四類：1、大量元素可以混在一起配制成10—20倍液，硫酸鎂和氯化鈣Ca２+和Mg2+會與磷酸鹽混合，產生不溶性沉淀，要分別單獨配制,Ca２+與PO4-一起混合易沉淀，定容后消失。第26頁/共97頁2、微量元素可配成100—200倍混合母液，KI可單獨配。3、鐵鹽硫酸亞鐵和EDTA鈉鹽易沉淀，需單獨配制，配成100—200倍鰲合劑不易沉淀。4、有機化合物維生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200倍液，也可分別配制。第27頁/共97頁（二）植物生長調節(jié)物質的配制植物生長調節(jié)物質分別配成母液儲于冰箱，濃度一般為0.5－1mg/ml。1、IAA、NAA：先用少量95%酒精使之充分溶解。2、2,4－D：可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再緩緩加蒸餾水定容至需要的體積。3、KT和BA等細胞分裂素類：先用少量0.1mol/L的HCl溶解，再用蒸餾水定容至需要的體積。第28頁/共97頁（三）藥品用量的計算：配制母液時藥品用量(mg)=配方用量(mg)×濃縮倍數(shù)×制備容量（L）

第29頁/共97頁二、培養(yǎng)基的制作（一）母液取用量的計算制備培養(yǎng)基時母液取用量（ml）=1000÷濃縮倍數(shù)×制備培養(yǎng)基數(shù)量（L）第30頁/共97頁（二）培養(yǎng)基制作程序1、按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分順序將母液取出，混合。2、適量蒸餾水放入加熱容器，蒸餾水應少于所制培養(yǎng)基數(shù)量，約終體積的2/3-3/4，接通電源加熱。3、向加熱容器中加入稱量好的瓊脂（0.6-0.8%），攪拌加熱，至完全溶化。第31頁/共97頁4、瓊脂熬化后，稱取相應量的蔗糖（2-3%），加入加熱容器中至溶解。5、將母液混合液加入到加熱容器中，攪拌混勻。6、蒸餾水定容至所需體積。7、測試培養(yǎng)基溶液的PH值(5.8-6.0)，過高滴加0.1mol/L的HCL調整，過低滴加0.1mol/L的NaOH調整。8、迅速分裝到培養(yǎng)瓶中，備用。

第32頁/共97頁培養(yǎng)基制作程序圖第33頁/共97頁培養(yǎng)基是離體培養(yǎng)物賴以生存和生長的人工環(huán)境的重要組成部分，常用的培養(yǎng)基依據(jù)其物理狀態(tài)的不同分為固態(tài)培養(yǎng)基和液態(tài)培養(yǎng)基。

固態(tài)培養(yǎng)基一般使用瓊脂為凝固劑，也有使用卡拉膠或魔芋粉為凝固劑的。液態(tài)培養(yǎng)基不使用凝固劑，但需要在容器中置入適當?shù)闹挝?，試管為培養(yǎng)容器的支撐物可用濾紙橋，底面積較大的培養(yǎng)容器，支撐物可選用脫脂棉等。第34頁/共97頁固體培養(yǎng)基第35頁/共97頁三、培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌制備好的培養(yǎng)基如果帶菌，會導致植物離體培養(yǎng)失敗，因而還要對培養(yǎng)基進行滅菌處理。（一）高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基的滅菌一般采用濕熱滅菌法：1、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋。2、滅菌鍋加水至淹沒電熱絲。第36頁/共97頁3、封閉高壓滅菌鍋各出氣口。4、接通電源加壓至49kPa（0.05MPa）5、打開排氣閥，排冷氣至壓力0kPa。6、繼續(xù)加壓至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃）7、壓力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃）時，穩(wěn)壓在此壓力15-20min。8、關閉電源自然冷卻至壓力為0kPa。9、取出培養(yǎng)基和器械冷卻，貯存于30℃以下室內。

第37頁/共97頁（二）干熱滅菌培養(yǎng)瓶、三角瓶、試管等玻璃器皿及接種器械，可以進行干熱滅菌。即將洗滌干凈的玻璃器皿放到烘箱中，在150℃溫度下，干熱滅菌1小時，或120℃下滅菌2小時。滅菌完畢冷卻后取出器械貯存。第38頁/共97頁

貯存室要保持無菌、干燥、以免造成培養(yǎng)基的二次污染。滅菌后的培養(yǎng)基一般應在2周內使用，時間過長易造成潛在的污染。培養(yǎng)基滅菌后如果出現(xiàn)過多沉淀或瓊脂不凝固等現(xiàn)象，該培養(yǎng)基不能繼續(xù)使用，應查明原因重新配制。第39頁/共97頁第四節(jié)

外植體無菌接種

一般來說，無論何種類型的細胞工程技術，起始階段均涉及外植體取材、滅菌、接種與培養(yǎng)等基本過程。第40頁/共97頁一、植物材料的培養(yǎng)與取材

外植體—是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料，是植物離體培養(yǎng)的基礎材料。第41頁/共97頁1、外植體的來源-生長在自然環(huán)境下的植物-有目的地培育在溫室控制條件下生長的植物-無菌環(huán)境下已經過離體培養(yǎng)的植物自然環(huán)境中生長的植株，一般帶有微生物，甚至與某些微生物具有寄生關系，使植株具有內生菌。取自這些植物的外植體，在培養(yǎng)過程中會有微生物滋生，從而影響培養(yǎng)效果。第42頁/共97頁自然環(huán)境生長植株第43頁/共97頁溫室控制條件下生長植株第44頁/共97頁已離體培養(yǎng)植株第45頁/共97頁多數(shù)情況下，應盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來源，減少培養(yǎng)過程中的微生物感染概率。同時，生長在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)料間的一致性，提高實驗的可重復性，也便于培養(yǎng)技術的規(guī)范。第46頁/共97頁某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長的植物，就需要盡可能避免使用那些生長過于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對于培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)內生菌污染的材料，應盡量取生長旺盛期的生長點部位作為起始培養(yǎng)的材料。

第47頁/共97頁2、供體植株的管理取自室外的外植體材料，供體植株的管理十分重要，這與外植體培養(yǎng)時的污染率密切相關。植株管理中應注意：⑴避免昆蟲危害許多昆蟲如蚜蟲、螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介，會引起植物組織的潛在感染。第48頁/共97頁⑵注意防病尤其是真菌和細菌病害的侵染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的污染率遠遠高于來自健康植株的外植體，必要時需使用化學藥劑防治病害。⑶控制濕度給供體植株澆水時應從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。第49頁/共97頁1、材料取材⑴材料選擇培養(yǎng)材料應選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質或特殊的基因型?？焖俜敝硶r應在植株生長的最適時期取材，花藥培養(yǎng)應在花粉發(fā)育到單核期取材。第50頁/共97頁第51頁/共97頁第52頁/共97頁第53頁/共97頁第54頁/共97頁選取材料的大小一般在0.5-1.0cm之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小難于成活。⑵采收從生長健壯的無病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織。最好采用莖尖，后代性狀較穩(wěn)定，攜帶細菌較少。第55頁/共97頁二、預處理與表面滅菌1、預處理先對植物材料進行修剪整理，去掉不需要部分，將準備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗20-60分鐘，備用。如特別不潔的外植體，可先用加有洗滌劑的水清洗10-15分鐘，再用流水沖洗干凈。第56頁/共97頁2、表面滅菌（1）操作人員穿戴滅菌過的工作服、口罩。進入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈，操作前再用70%酒精或消毒劑擦洗雙手。（2）操作期間雙手和臺面常用70%酒精或消毒劑擦拭。超凈工作臺使用前必須用紫外燈照射殺菌，然后開啟風機。第57頁/共97頁

（3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入70-75%酒精中，使用時需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。（4）外植體放入超凈工作臺內，置70-75%酒精中5-60秒，0.1氯化汞6-10分鐘，或10%的漂白粉上清液中10-15分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次。滅菌時需進行攪動。

第58頁/共97頁表面滅菌劑種類較多，可選取1-2種使用。

常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑使用濃度持續(xù)時間

去除的難易效果

次氯酸鈣9-10％5-30分鐘

易很好

次氯酸鈉2％5-30分鐘易很好

氯化汞0.1-1％5-10分鐘較難最好

抗菌素4-50mg／L30-60分鐘中較好

酒精70-75%0.2-2分鐘易好過氧化氫10-12%5-15分鐘最易好第59頁/共97頁三、外植體的接種—無菌接種外植體的接種是把經過表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞、轉放到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。整個過程均需無菌操作。（1）借助接種用工具將材料切割分離。第60頁/共97頁（2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺內，火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口，然后打開培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜角，避免灰塵落入平中。（3）迅速將切割分離下的所需組織、細胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時蓋上瓶蓋。（4）工具用后應及時滅菌，避免交叉污染。（5）工作人員操作時禁止不必要的談話。第61頁/共97頁第五節(jié)外植體的培養(yǎng)

接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步，植物離體培養(yǎng)和栽培植物一樣，生長過程中也受到各種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎上，影響試管苗生長的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。第62頁/共97頁一、外植體的培養(yǎng)條件1、光照光照對植物生長發(fā)育有重要作用，是離體培養(yǎng)中非常重要的環(huán)境因素。光照強度、光質以及光照時間，對細胞的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊要求外，一般都采用日光燈作光源，光照強度1000-5000Lx，根據(jù)不同植物或器官需要，可以每天連續(xù)光照12-16小時，也可每天光照16小時，8小時黑暗。第63頁/共97頁2、溫度離體培養(yǎng)中對溫度的控制比光照更為重要，大所數(shù)植物最適溫度在23-32℃之間。培養(yǎng)室溫度是25±2℃。低于15℃時，培養(yǎng)的組織生長停頓，高于35℃對生長也不利。因此，培養(yǎng)室應安裝空調機或其他的控溫設備。第64頁/共97頁3、濕度培養(yǎng)瓶內相對濕度通常是100%，而環(huán)境中的相對濕度會直接影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。因此，培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)室一般要求相對濕度保持在70-80%，相對濕度過低影響培養(yǎng)物生長和分化，應向室內噴灑水，以提高濕度；過高雜菌滋生，大量污染，應及時地通風除濕。第65頁/共97頁4、氧氣離體培養(yǎng)的試管苗是需要氧氣的，在固體培養(yǎng)或液體靜置培養(yǎng)時，如果組織完全浸入培養(yǎng)基中，與氧氣隔絕，就會停止生長。因此，接種時要有部分組織合空氣接觸。振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生長，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來的CO2，有利于外植體外層細胞開始分裂。第66頁/共97頁組織培養(yǎng)步驟圖第67頁/共97頁（1）準備階段

查閱相關文獻，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結合實際制定出切實可行的培養(yǎng)方案。根據(jù)實驗方案配制適當?shù)幕瘜W消毒劑以及不同培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)基，并經高壓滅菌或過濾除菌后備用。（2）外植體的選擇與消毒

選擇合適的部位作為外植體，采回后經過處理，然后進行消毒處理。將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊，或剝離出莖尖、挑出花藥，接種到啟動培養(yǎng)基上。第68頁/共97頁（3）啟動培養(yǎng)

接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使外植體中已分化的細胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋芽直接萌發(fā)形成芽。將愈傷組織轉移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。（4）增殖培養(yǎng)

分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限，采用適當?shù)脑鲋撑囵B(yǎng)基經反復多次切割轉接。當芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根，另一部分保存或繼續(xù)擴繁。進行脫毒苗培養(yǎng)的還要進行病毒檢測。

第69頁/共97頁（5）生根培養(yǎng)剛形成的芽苗往往比較弱小，多數(shù)無根，此時可降低或不加細胞分裂素濃度，提高生長素濃度，促進芽苗生根，提高其健壯度。（6）煉苗移栽選擇生長健壯，有3～5條根的生根苗進行煉苗，移栽到疏松透氣的基質中，注意保溫、保濕、遮蔭。當苗完全成活后，再移向大田。第70頁/共97頁擬定培養(yǎng)方案外植體預處理外植體無菌接種啟動培養(yǎng)分化出芽、胚狀體或原球莖繼代增殖培養(yǎng)生根培養(yǎng)煉苗移栽成活供生產使用植物組織培養(yǎng)的一般程序

培養(yǎng)基配制滅菌第71頁/共97頁二、外植體的成苗途徑（第三章后講）外植體的成苗途徑有三種：（一）外植體-愈傷組織-完整植株。具體又可分為三種：1、愈傷組織-同時長芽和根-植株。2、愈傷組織-莖-根-植株。3、愈傷組織-根-芽-植株。第72頁/共97頁（二）外植體-胚狀體-植株?？蓮囊韵聨追N培養(yǎng)物中產生：1、器官上發(fā)生。2、愈傷組織上發(fā)生。3、游離單細胞發(fā)生。4、小孢子發(fā)生。誘導胚狀體比誘導芽數(shù)量多、速度快、結構完整。（三）外植體-直接形成根與芽-植株。如莖尖培養(yǎng)第73頁/共97頁第74頁/共97頁三、培養(yǎng)中常見問題（一）污染的原因及其預防措施1、污染原因污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。病原菌：細菌及真菌兩大類。第75頁/共97頁⑴細菌污染特點-菌斑呈黏液狀，接種后1-2天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：外植體帶菌培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程

⑵真菌污染的特點-污染部分長有不同顏色的霉菌，接種后3-10天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：周圍環(huán)境不清潔超凈工作臺過濾裝置失效培養(yǎng)瓶的口徑過大第76頁/共97頁2、污染的預防措施⑴防止材料帶菌的措施-莖尖作外植體時，進行預培養(yǎng)（無糖）或暗培養(yǎng)。無糖營養(yǎng)液或自來水使枝條抽枝，以新抽嫩枝作外植體。-晴天取材，下午取材，經日曬過可殺死部分細菌或真菌。-接種時除去外部韌皮組織，只接內部的分生組織。第77頁/共97頁（2）外植體的滅菌-多次滅菌法，次氯酸鈉-無菌水-次氯酸鈉-多種藥液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸鈉-無菌水。第78頁/共97頁⑶器皿與金屬器械的滅菌玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌金屬器皿一般火焰滅菌，也可干熱滅菌⑷布質制品的滅菌濕熱滅菌⑸無菌操作室的滅菌

2%新捷爾滅或70%酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。⑹嚴格按照操作程序。第79頁/共97頁（二）外植體的褐變及其防止措施。1、褐變的原因褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內的多酚氧化酶被激活，使細胞內的酚類物質氧化成棕褐色的醌類物質，這種致死的褐變物向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。

第80頁/共97頁⑴基因型某些植物酚類物質含量較多。⑵外植體的生理狀態(tài)幼年的材料培養(yǎng)含醌類物質較少。⑶培養(yǎng)基的成分-過高的無機鹽濃度-生長調節(jié)物質使用不當，BA過多-分生能力強的材料，氧化受抑制，褐變也被抑制-培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強，褐變加速。⑷材料轉移時間時間過長引起材料褐變。第81頁/共97頁2、褐變的防止措施⑴選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基。⑵連續(xù)轉移。⑶加抗氧化物。⑷加活性炭。0.1-0.5%活性炭

第82頁/共97頁（三）玻璃化現(xiàn)象及其預防措施1、玻璃化現(xiàn)象及其產生原因玻璃化是在細胞生長過程中的環(huán)境產生變化，試管苗為了適應變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。主要原因是：⑴激素濃度BA濃度提高，導致玻璃化苗的產生。⑵瓊脂濃度瓊脂濃度低，玻璃化苗增加。第83頁/共97頁⑶溫度低溫易形成玻璃化苗。⑷光照時間一般要求10-12h，大于15h玻璃苗增加。⑸通風條件培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換不良，玻璃化苗多。⑥離子水平植物種類不同，離子形態(tài)比例量要求不同。第84頁/共97頁2、預防措施⑴控制無機營養(yǎng)成分，降低氮（銨態(tài)氮）和氯。⑵提高蔗糖和瓊脂濃度⑶降低細胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長素比例。⑷增加自然光照1000-1800lx，控制光照時間8-12h。⑸適溫生長，熱擊處理防止玻璃化發(fā)生。⑥使用透氣性好的封口膜。⑺培養(yǎng)基中加入間苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壯素。

第85頁/共97頁第五節(jié)試管苗的馴化移栽（后講）一、試管苗的特點1、試管苗的生態(tài)環(huán)境組織培養(yǎng)出來的苗通稱試管苗或組培苗。試管苗長期生活在密閉容器中，形成其獨特生態(tài)系統(tǒng)，與外界環(huán)境相比，有四大差異第86頁/共97頁⑴高恒溫試管苗整個生長過程中