氨基酸薄層層析

氨基酸薄層層析第1頁(yè)/共28頁(yè)如何分離鑒定氨基酸混合液？生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心第2頁(yè)/共28頁(yè)氨基酸的薄層層析

(Thinlayerchromatographyofaminoacids)

第3頁(yè)/共28頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆毡訉游龇ǖ囊话阍怼Ｕ莆瞻被岜訉游龇ǖ幕静僮骷夹g(shù)。掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（Rf值）來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。第4頁(yè)/共28頁(yè)層析基本概念層析技術(shù)是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動(dòng)相從固定相上流過(guò)，不同組分以不同速度而最終被分離。特點(diǎn)：分離效率高，能分離各種性質(zhì)相類(lèi)似的物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分離純化，也可用于大量物質(zhì)的分離純化和制備。第5頁(yè)/共28頁(yè)層析基本概念固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。包括固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等）和液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。流動(dòng)相：在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)移動(dòng)的液體、氣體等，都稱(chēng)為流動(dòng)相。柱層析中一般稱(chēng)為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱(chēng)為展層劑。第6頁(yè)/共28頁(yè)層析技術(shù)的分類(lèi)（1）按兩相所處狀態(tài)，可分為液相層析和氣相層析，前者以液體為流動(dòng)相，后者以氣體為流動(dòng)相。（2）按操作形式不同，可分為柱層析、薄層層析和紙層析。（3）按層析的原理不同，可分為吸附層析、分配層析、凝膠層析、離子交換層析和親和層析等。今天要做的試驗(yàn)，根據(jù)原理屬于吸附層析，根據(jù)操作形式又屬于薄層層析，合到一起叫：吸附薄層層析。第7頁(yè)/共28頁(yè)硅膠薄層層析第8頁(yè)/共28頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理

1.薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種

一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開(kāi)溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開(kāi)溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開(kāi)劑的移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開(kāi)。（即通過(guò)吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開(kāi)來(lái)）第9頁(yè)/共28頁(yè)硅膠吸附薄層層析實(shí)驗(yàn)原理吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠

硅膠：表達(dá)式為SiO2·XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性硅醇基（－Si－OH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附.第10頁(yè)/共28頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)：

①硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。②硅醇基顯較弱的酸性，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。③硅膠的活化溫度通常為105℃－110℃，不能過(guò)高。第11頁(yè)/共28頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理

2.氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它與氨基酸的羧基反應(yīng)生成還原茚三酮、氨及醛，與此同時(shí)，還原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生成紫紅化合物而使氨基酸斑點(diǎn)顯色。第12頁(yè)/共28頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理3.混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對(duì)遷移率—Rf值（rateofflow）來(lái)表示。

層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值。由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動(dòng)速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。第13頁(yè)/共28頁(yè)實(shí)驗(yàn)材料吸附劑：硅膠粘合劑：0.5%的羧甲基纖維素鈉氨基酸的異丙醇溶液

丙氨酸、精氨酸、甘氨酸展開(kāi)-顯色劑（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）分析樣品：氨基酸混合液第14頁(yè)/共28頁(yè)器材層析板、尺子、鉛筆燒杯、玻棒、量筒吹風(fēng)機(jī)毛細(xì)管、層析缸藥匙烘箱第15頁(yè)/共28頁(yè)薄層層析裝置第16頁(yè)/共28頁(yè)操作步驟—薄層板的制備

1、調(diào)漿稱(chēng)取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調(diào)成均勻的糊狀。

2、涂布取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。

3、干燥將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。

4、活化

70℃烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時(shí)取出。第17頁(yè)/共28頁(yè)層析板制備第18頁(yè)/共28頁(yè)2cm1cm1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線(xiàn)上均勻確定4個(gè)點(diǎn)。每個(gè)樣品間相距約1cm。2、取樣：用毛細(xì)管分別吸取氨基酸溶液，取樣量為毛細(xì)管柱高5cm。3、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣毛細(xì)管輕輕接觸薄層表面點(diǎn)樣。加樣后原點(diǎn)擴(kuò)散直徑不超過(guò)2mm。

AlaArgGlyMix輕觸疾起操作步驟—點(diǎn)樣第19頁(yè)/共28頁(yè)點(diǎn)樣操作第20頁(yè)/共28頁(yè)操作步驟—

展層、顯色AlaArgGlyMix

將薄層板點(diǎn)樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應(yīng)低于點(diǎn)樣線(xiàn)。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄板頂端2cm時(shí)，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線(xiàn)，用熱風(fēng)吹干或在85℃下烘干，即可顯出各層斑點(diǎn)。第21頁(yè)/共28頁(yè)試樣展開(kāi)過(guò)程第22頁(yè)/共28頁(yè)結(jié)果計(jì)算Rf=斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離溶劑前緣至原點(diǎn)距離

小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，計(jì)算出它們的Ｒｆ值。

根據(jù)Ｒｆ值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類(lèi)，并繪出層析圖譜。第23頁(yè)/共28頁(yè)Rf值測(cè)量第24頁(yè)/共28頁(yè)數(shù)據(jù)處理樣品ArgGlyAla混合液斑點(diǎn)-原點(diǎn)溶劑前緣-原點(diǎn)Rf值第25頁(yè)/共28頁(yè)注意事項(xiàng)1.切勿用手直接接觸薄層板面。2.點(diǎn)樣過(guò)程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。3.樣