熒光光譜原理與運(yùn)用

概述基本原理熒光分析方法熒光法的應(yīng)用第一頁(yè)，共41頁(yè)。熒光當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光（通常波長(zhǎng)在可見(jiàn)光波段）；且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。如右圖為含有奎寧的通寧水在紫外線的照射下發(fā)出熒光。第二頁(yè)，共41頁(yè)。熒光的分類自發(fā)熒光誘發(fā)熒光物質(zhì)經(jīng)過(guò)紫外線照射后發(fā)出熒光的現(xiàn)象可分為兩種情況:如葉綠素、血紅素等經(jīng)紫外線照射后，能發(fā)出紅色的熒光物體經(jīng)熒光染料染色后再通過(guò)紫外線照射發(fā)出熒光第三頁(yè)，共41頁(yè)。熒光分析法熒光分析是指利用某些物質(zhì)在被短波長(zhǎng)光（一般為紫外光）激發(fā)后產(chǎn)生熒光的特性及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量的分析的方法。第四頁(yè)，共41頁(yè)。熒光光譜法的特點(diǎn)①靈敏度高最低檢出限：質(zhì)量分?jǐn)?shù)10-6~10-9數(shù)量級(jí)，適用于痕量物質(zhì)檢測(cè)靈敏度比紫外-可見(jiàn)分光光度法約高2~4個(gè)數(shù)量級(jí)②選擇性好只要利用單色器控制激發(fā)光和熒光的波長(zhǎng)，通過(guò)前后兩次波長(zhǎng)的選擇，可得到比吸收光度計(jì)更強(qiáng)的選擇性。③應(yīng)用還不夠廣泛，尚待拓寬多數(shù)物質(zhì)本身不會(huì)產(chǎn)生熒光，一些物質(zhì)在加入某種試劑后能夠產(chǎn)生熒光；對(duì)環(huán)境因素（溫度，酸度、溶解氧）極為敏感第五頁(yè)，共41頁(yè)。熒光分析法的基本原理第六頁(yè)，共41頁(yè)。（1）分子的激發(fā)

基態(tài)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)）

單重態(tài)：分子中所有電子自旋都配對(duì)的電子狀態(tài)

三重態(tài)：有兩個(gè)電子的自旋不配對(duì)而平行的狀態(tài)

1.分子的激發(fā)與失活第七頁(yè)，共41頁(yè)。1.分子的激發(fā)與失活（2）分子的失活處于激發(fā)態(tài)的分子很不穩(wěn)定，可能經(jīng)過(guò)輻射躍遷和非輻射躍遷的衰變過(guò)程而返回基態(tài)。輻射躍遷非輻射躍遷熒光磷光振動(dòng)松弛內(nèi)轉(zhuǎn)化系間竄越第八頁(yè)，共41頁(yè)。l2l1l

3l

2T1S0S1S2熒光磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)化內(nèi)轉(zhuǎn)化系間竄越振動(dòng)松弛2.分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過(guò)程第九頁(yè)，共41頁(yè)。振動(dòng)弛豫：由于分子間的碰撞，激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中的較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程，其效率較高。

激發(fā)態(tài)分子常常首先發(fā)生振動(dòng)馳豫。內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的兩個(gè)電子能級(jí)間，電子由高能級(jí)回到低能級(jí)的分子內(nèi)過(guò)程。

①無(wú)輻射躍遷

第十頁(yè)，共41頁(yè)。系間竄越：激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過(guò)程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系間竄躍最常見(jiàn)。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)相互作用和能量轉(zhuǎn)換而使熒光（或磷光）減弱甚至消失的過(guò)程。熒光強(qiáng)度的減弱或消失，稱為熒光熄滅或猝滅。

第十一頁(yè)，共41頁(yè)。②輻射躍遷熒光：受光激發(fā)的分子經(jīng)振動(dòng)馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、振動(dòng)馳豫到達(dá)第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，以輻射的形式失活回到基態(tài)，發(fā)出熒光。

由于無(wú)輻射使分子吸收的能量有部分損失，因此熒光的能量比吸收的能量小，即熒光波長(zhǎng)一般比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。第十二頁(yè)，共41頁(yè)。磷光：若第一激發(fā)單重態(tài)的分子通過(guò)系間竄躍到達(dá)第一激發(fā)三重態(tài)，再通過(guò)振動(dòng)馳豫轉(zhuǎn)至該激發(fā)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后以輻射的形式回到基態(tài)，發(fā)出的光線稱為磷光。由于激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低，所以磷光的波長(zhǎng)比熒光的波長(zhǎng)稍長(zhǎng)。磷光僅在很低的溫度或黏性介質(zhì)中才能觀測(cè)到。因此磷光很少應(yīng)用于分析。第十三頁(yè)，共41頁(yè)。3.熒光產(chǎn)生的過(guò)程：（1）處于基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的熒光物質(zhì)分子受到紫外線的照射，吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)；（2）被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)的分子通過(guò)

無(wú)輻射躍遷降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；（3）降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子繼續(xù)降落到基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)射出相應(yīng)的光量子，這就是熒光；（4）到達(dá)基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)的分子再通過(guò)無(wú)輻射躍遷最后回到基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)．第十四頁(yè)，共41頁(yè)。4.熒光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

電子躍遷類型

*→的熒光效率高，系間竄躍至三重態(tài)的的速率常數(shù)較小，有利于熒光的產(chǎn)生。共軛效應(yīng)含有*→躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最常見(jiàn)且最強(qiáng)。具有較大共軛體系或脂環(huán)羰基結(jié)構(gòu)的脂肪族化合物也可能產(chǎn)生熒光。第十五頁(yè)，共41頁(yè)。熒光產(chǎn)生的過(guò)程：（1）處于基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的熒光物質(zhì)分子受到紫外線的照射，吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)；（2）被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)的分子通過(guò)無(wú)輻射躍遷降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；（3）降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子繼續(xù)降落到基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)射出相應(yīng)的光量子，這就是熒光：（4）到達(dá)基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)的分子再通過(guò)無(wú)輻射躍遷最后回到基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)．第十六頁(yè)，共41頁(yè)。2.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）分子必須具有與所照射的輻射頻率(紫外-可見(jiàn)光）相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)（共軛π鍵），才能吸收激發(fā)光

（2）吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

第十七頁(yè)，共41頁(yè)。（1）熒光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

電子躍遷類型

*→的熒光效率高，系間竄躍至三重態(tài)的的速率常數(shù)較小，有利于熒光的產(chǎn)生。共軛效應(yīng)含有*→躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最常見(jiàn)且最強(qiáng)。具有較大共軛體系或脂環(huán)羰基結(jié)構(gòu)的脂肪族化合物也可能產(chǎn)生熒光。第十八頁(yè)，共41頁(yè)。取代基效應(yīng)：苯環(huán)上有吸電子基常常會(huì)妨礙熒光的產(chǎn)生；而給電子基會(huì)使熒光增強(qiáng)。

化合物相對(duì)熒光強(qiáng)度熒光波長(zhǎng)/nmC6H6（苯）10270~310C6H5COOHC6H5NO230310~390C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020270~320285~365285~345310~405280~360C6H5ClC6H5BrC6H5I750275~345290~380第十九頁(yè)，共41頁(yè)。平面剛性結(jié)構(gòu)效應(yīng)

可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。第二十頁(yè)，共41頁(yè)。（2）熒光量子產(chǎn)率Φ

物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（Φ）表示：Φ與失活過(guò)程的速率常數(shù)k有關(guān)：凡是使熒光速率常數(shù)kf增大而使其他失活過(guò)程（系間竄越、外轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換）的速率常數(shù)減小的因素（環(huán)境因素和結(jié)構(gòu)因素）都可使熒光增強(qiáng)。第二十一頁(yè)，共41頁(yè)。3.熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的輻射，熒光強(qiáng)度（F）與①熒光物質(zhì)的吸光程度②發(fā)射熒光的能力有關(guān)：

F=K′（I0—I）

I0

—入射光輻射強(qiáng)度；I

—透射光輻射強(qiáng)度；

K′—取決于熒光量子產(chǎn)率（Ф）。第二十二頁(yè)，共41頁(yè)。Lambert-Beer定律：=第二十三頁(yè)，共41頁(yè)。溶液濃度較低時(shí)：

當(dāng)入射光的λ1和I0一定時(shí)：

F=Kc

即：

在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。

————這是熒光法定量的基礎(chǔ)。

但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng)kbc0.05時(shí)才成立。對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。第二十四頁(yè)，共41頁(yè)。4.影響熒光強(qiáng)度的因素（1）內(nèi)部因素自猝滅——發(fā)光物質(zhì)分子間碰撞而發(fā)生的能量無(wú)輻射轉(zhuǎn)移。自猝滅隨溶液濃度的增加而增加。自吸收——熒光化合物的發(fā)射的波長(zhǎng)與其吸收的波長(zhǎng)重疊，溶液內(nèi)部激發(fā)態(tài)分子所發(fā)射的熒光在通過(guò)外部溶液時(shí)被同類分子吸收，而使熒光被減弱。熒光強(qiáng)度F與光源的輻射強(qiáng)度I0有關(guān)，因此增大光源輻射功率I0可提高熒光測(cè)定的靈敏度。第二十五頁(yè)，共41頁(yè)。（2）環(huán)境因素

②pH值

含有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與pH有關(guān)。pH的變化影響了熒光基團(tuán)的電荷狀態(tài)，從而使其熒光發(fā)生變化。③溶解氧

往往使熒光強(qiáng)度降低化合物相對(duì)熒光強(qiáng)度C6H5OH18C6H5O—

0C6H5NH2

20C6H5NH3

+0①溫度

溫度降低會(huì)減少碰撞和非輻射失活的概率，因此會(huì)增加熒光強(qiáng)度。

第二十六頁(yè)，共41頁(yè)。熒光分析儀第二十七頁(yè)，共41頁(yè)。光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器熒光分光光度計(jì)與紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？熒光分光光度計(jì)掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長(zhǎng)掃描發(fā)射光譜消除干擾波長(zhǎng)范圍：200~800nm最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源第二十八頁(yè)，共41頁(yè)。光源：氙燈、高壓汞蒸氣燈單色器：激發(fā)單色器——選擇激發(fā)光波長(zhǎng)熒光單色器——選擇(測(cè)量)發(fā)射光（熒光）波長(zhǎng)，與激發(fā)光入射方向垂直。樣品池：采用低熒光材料，通常為石英池檢測(cè)器：光電倍增管第二十九頁(yè)，共41頁(yè)。

熒光法的應(yīng)用第三十頁(yè)，共41頁(yè)。1.熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（1）熒光發(fā)射光譜：固定激發(fā)光的波長(zhǎng)，測(cè)量不同熒光波長(zhǎng)處熒光的強(qiáng)度，得到熒光光譜，即熒光強(qiáng)度—熒光波長(zhǎng)圖。

（2）熒光激發(fā)光譜（吸收光譜）：在熒光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處測(cè)量隨激發(fā)光波長(zhǎng)的改變而變化的熒光強(qiáng)度，得到熒光激發(fā)光譜。即熒光強(qiáng)度-激發(fā)光波長(zhǎng)圖。

第三十一頁(yè)，共41頁(yè)。第三十二頁(yè)，共41頁(yè)。a.Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。熒光的波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光的波長(zhǎng)，這是由于振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換過(guò)程損失了一定的能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。c.鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系第三十三頁(yè)，共41頁(yè)。2.定量分析方法定量方法：①標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度。②比較法：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，再進(jìn)行比較。定量依據(jù)：低濃度時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比

F=KC第三十四頁(yè)，共41頁(yè)。3.無(wú)機(jī)物的熒光分析無(wú)機(jī)物能夠直接產(chǎn)生熒光并用于測(cè)定的很少。可通過(guò)與熒光試劑作用生成熒光配合物、或通過(guò)催化或猝滅熒光反應(yīng)進(jìn)行熒光分析。非過(guò)渡金屬離子的熒光配合物較多?？捎糜跓晒夥治龅脑匾呀?0種。熒光試劑是具有兩個(gè)或以上與MZ+形成螯合物的電子給予體官能團(tuán)的芳香結(jié)構(gòu)。OHNSO3NaN=NOHHOON8-羥基喹啉石榴茜素R第三十五頁(yè)，共41頁(yè)。無(wú)機(jī)化合物的分析：鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定。第三十六頁(yè)，共41頁(yè)。4.有機(jī)物的熒光分析熒光法在有機(jī)化合物中應(yīng)用較廣。芳香化合物多能發(fā)生熒光。脂肪族化合物往往與熒光試劑作用后才可產(chǎn)生熒光。名稱結(jié)構(gòu)式應(yīng)用9-蒽基重氮甲烷某些羧酸丹磺酰氯伯胺、仲胺、酚或氨基酸CH2N2N(CH3)2SO2Cl第三十七頁(yè)，共41頁(yè)。鋅(Ⅱ)存在下諾氟沙星與

牛血清白蛋白的結(jié)合作用 以λex=280nm，分別加入NF