細(xì)胞培養(yǎng)中的研究方法課件

細(xì)胞培養(yǎng)中的研究方法內(nèi)容提要一、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察二、細(xì)胞活力測(cè)定三、細(xì)胞凋亡檢測(cè)四、流式細(xì)胞術(shù)五、常用單細(xì)胞分離技術(shù)一、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察1.常規(guī)觀察2.細(xì)胞計(jì)數(shù)3.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線4.細(xì)胞分裂指數(shù)5.細(xì)胞貼壁率6.細(xì)胞周期2.細(xì)胞計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法電子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法細(xì)胞數(shù)/ml＝（4大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法電子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法原理：臺(tái)盼藍(lán)排斥法。再結(jié)合CCD成像，快速準(zhǔn)確完成細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率計(jì)數(shù)。電子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)結(jié)果3.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞必須生長(zhǎng)特征穩(wěn)定，可采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線來(lái)觀察細(xì)胞狀態(tài)。方法：①取生長(zhǎng)狀態(tài)較好細(xì)胞接種24孔板，每天或隔天計(jì)數(shù)（3個(gè)復(fù)孔），計(jì)數(shù)1-2周，以細(xì)胞數(shù)對(duì)時(shí)間作圖繪制生長(zhǎng)曲線。②用MTT法測(cè)定96孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞倍增時(shí)間：細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需時(shí)間。作圖法：直接從圖上找出公式法:lg2DT=tlgNt-lgNoNt:培養(yǎng)t時(shí)間后細(xì)胞數(shù)No:首次計(jì)數(shù)，一般接種24h進(jìn)行5.細(xì)胞貼壁率6.細(xì)胞周期：同位素標(biāo)記、流式細(xì)胞儀二、細(xì)胞活力測(cè)定細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。

任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。（1）平板克隆形成試驗(yàn)適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞（腫瘤、正常）方法步驟：1.制備單細(xì)胞懸液2.接種細(xì)胞：倍比稀釋后接種于培養(yǎng)皿，每皿接50、100、200等梯度，輕搖（十字方向）使細(xì)胞分布均勻。3.培養(yǎng)：2-3周4.染色：甲醇固定、吉姆薩染液染色5.計(jì)數(shù)：肉眼或顯微鏡（2）軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)適用于懸浮細(xì)胞方法步驟1.制備單細(xì)胞懸液，103/ml2.制備底層瓊脂：50℃5%瓊脂以1：9和37℃新鮮培養(yǎng)基混合均勻鋪入24孔板，每孔1ml，室溫凝固3.50℃5%瓊脂以0.6：9.4和細(xì)胞懸液混合，加入上述24孔板，每孔1ml。調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)，一般每孔25、50、100個(gè)4.培養(yǎng)2-3周5.計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞充分分散2.平板試驗(yàn)培養(yǎng)早期勿晃動(dòng)平皿、軟瓊脂試驗(yàn)培養(yǎng)液與瓊脂液混勻。3.防治污染缺點(diǎn)：難獲得真正單細(xì)胞懸液有些腫瘤細(xì)胞集落形成率低確定集落有一定難度耗時(shí)長(zhǎng)，重復(fù)性差3.四唑鹽（MTT）比色法測(cè)定細(xì)胞存活和生長(zhǎng)?？焖佟⒑?jiǎn)單、靈敏度高三、細(xì)胞凋亡檢測(cè)1.形態(tài)學(xué)觀察2.電泳法3.原位切口末端標(biāo)記法（TUNEL）4.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法1.形態(tài)學(xué)觀察注意：1.提DNA時(shí)細(xì)胞數(shù)勿太多，否則酶解不全，DNA液粘稠2.盡量用去尖頭的槍頭吸取DNA液，防止人為剪切3.低電壓電泳，利于DNA分離200bp400bp600bp800bp3.原位切口末端標(biāo)記法（原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)，TUNEL）原理：細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶使核小體內(nèi)DNA斷裂出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3‘-OH末端。生物素（biotin）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下與3‘-OH末端連接，并與連接了的辣根過(guò)氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，加入DAB顯色底物可在原位出現(xiàn)棕沉淀，鏡下即可觀察和計(jì)數(shù)著色細(xì)胞；正?；蛘谠鲋车募?xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3’-OH形成，很少能夠被染色。組織樣本和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）均可檢測(cè)。

優(yōu)點(diǎn)：對(duì)完整凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確反應(yīng)凋亡細(xì)胞典型的生化和形態(tài)特征，極少量的凋亡細(xì)胞也可被檢測(cè)出來(lái)，靈敏度高于染色法和DNALadder，應(yīng)用廣。注意：1.設(shè)好陽(yáng)性及陰性對(duì)照，控制好藥物處理時(shí)間2.TDT酶與生物素-dUTP混合液現(xiàn)用現(xiàn)配3.DAB顯色時(shí)間勿過(guò)長(zhǎng)4.細(xì)胞爬片操作要輕柔4.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法(詳見(jiàn)下節(jié))四、流式細(xì)胞術(shù)20世紀(jì)70年代出現(xiàn)。特點(diǎn)：在單細(xì)胞水平上對(duì)大量細(xì)胞作準(zhǔn)確快速分析和分選。應(yīng)用：1.判斷細(xì)胞體積、DNA含量、蛋白含量、酶活性、細(xì)胞膜受體、表面抗原等。2.無(wú)菌狀態(tài)下，對(duì)活細(xì)胞分類收集，純度達(dá)99%。流動(dòng)室、液流系統(tǒng)激光光源光學(xué)系統(tǒng)光電管、檢測(cè)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)、分析系統(tǒng)工作原理：1.檢測(cè)單細(xì)胞不同指標(biāo)經(jīng)熒光染色的單細(xì)胞懸液在氣體壓力下進(jìn)入流動(dòng)室，在鞘液約束下細(xì)胞排成單列從噴嘴噴出，形成細(xì)胞流。其與激光束垂直相交，細(xì)胞被激發(fā)出熒光，經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)收集后，傳給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)儲(chǔ)存、分析并顯示。用不同單克隆抗體或熒光染料，可對(duì)一個(gè)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行多個(gè)參數(shù)檢測(cè)。當(dāng)細(xì)胞液滴逐個(gè)通過(guò)激光束時(shí)，干涉檢測(cè)器被激活，而帶熒光標(biāo)記的細(xì)胞同時(shí)也使熒光檢測(cè)器激活，液滴充電信號(hào)使液滴帶上負(fù)電荷，從而向正極移動(dòng)，進(jìn)入熒光標(biāo)記細(xì)胞收集器，純度達(dá)99%以上。無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行時(shí)，得到細(xì)胞仍可繼續(xù)體外培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)研究。2.細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀使用1.調(diào)試和校準(zhǔn)：激光強(qiáng)度、液流速度、光路等、由專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行。2.儀器操作：①打開(kāi)細(xì)胞儀②打開(kāi)聯(lián)機(jī)電腦③在氣壓閥減壓狀態(tài)下確認(rèn)鞘液桶充滿并保證管路通暢④氣壓閥加壓排出管路氣泡⑤樣品管加去離子水沖洗噴嘴系統(tǒng)⑥預(yù)熱5-10min開(kāi)始試驗(yàn)完畢后去離子水沖洗⑦分析結(jié)果常規(guī)樣品制備方法1.直接熒光標(biāo)記法：

直接用熒光素（FITC、PE等）標(biāo)記的抗體處理細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)（可同時(shí)加入幾種不同熒光標(biāo)記的抗體）。此法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析。2.間接熒光標(biāo)記法：細(xì)胞先與一抗結(jié)合，再加熒光標(biāo)記的二抗檢測(cè)。此法費(fèi)用低，但特異性差（二抗多為多克隆抗體），應(yīng)設(shè)好陰陽(yáng)對(duì)照。不適合細(xì)胞數(shù)少的標(biāo)本測(cè)定。應(yīng)用實(shí)例1.檢測(cè)細(xì)胞膜受體原理：細(xì)胞表面保留有完整的抗原，用熒光標(biāo)記的特異性抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，依熒光強(qiáng)度或陽(yáng)性百分率可知相應(yīng)抗原密度。步驟：①對(duì)數(shù)期細(xì)胞單細(xì)胞懸液，PBS洗滌，調(diào)濃度為1×107個(gè)/ml；②取100ul，加血清封閉；③加抗原避光孵育20min，PBS洗滌2次；④棄上清，用固定液固定細(xì)胞；⑤檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果注意事項(xiàng)1.上機(jī)前細(xì)胞濃度1×106個(gè)/ml，過(guò)高或低均影響結(jié)果2.設(shè)立對(duì)照3.抗體孵育后充分洗滌，輕柔混勻，低速離心，以減少重疊細(xì)胞和細(xì)胞碎片4.孵育時(shí)避光2.同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外抗原原理：先標(biāo)記膜抗原，固定后用破膜劑或打孔劑將胞膜破壞，再標(biāo)記胞內(nèi)抗原，測(cè)定陽(yáng)性百分率。注意：抗原用不同熒光標(biāo)記設(shè)立陰性對(duì)照避光操作原理：碘化丙啶（PI）可與胞內(nèi)DNA及RNA結(jié)合，用RNA酶消化后，PI的熒光強(qiáng)度反應(yīng)胞內(nèi)DNA含量。因細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，故區(qū)分出來(lái)。G1/G0：二倍體細(xì)胞DNA含量（2N）G2/M：4NS：二者之間凋亡細(xì)胞總DNA含量降低，在G1/G0細(xì)胞群前出現(xiàn)一DNA低染細(xì)胞群，即G1峰前出現(xiàn)二倍體峰，即凋亡細(xì)胞群。3.細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)方法步驟：1.收集不同方法或藥物處理的細(xì)胞，70%冷乙醇固定20min，4℃放置（最長(zhǎng)4周）2.PBS清洗兩次出去固定液，PBS調(diào)細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml3.加入RNaseA消化半小時(shí)，加入PI，4℃避光20min4.檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果：注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞收集后及時(shí)固定，防止自溶或DNA降解2.要用對(duì)細(xì)胞穿透性強(qiáng)的固定劑，一般70%乙醇3.上機(jī)檢測(cè)前細(xì)胞濃度要足夠，一般1×106個(gè)/ml，雜質(zhì)、碎片和重疊細(xì)胞<2%（可用合適目數(shù)篩子過(guò)濾）4.反應(yīng)的凋亡結(jié)果應(yīng)考慮的因素：DNA含量降低或DNA結(jié)構(gòu)改變使DNA可染性降低。原理：正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡早期，PS翻轉(zhuǎn)到膜外。膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）是一種磷脂結(jié)合蛋白，可與PS特異性結(jié)合，檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。以熒光素FITC標(biāo)記的Annexin-V作探針，配合PI，可用流式細(xì)胞儀將凋亡早期。凋亡晚期及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。

4.細(xì)胞凋亡和壞死檢測(cè)方法步驟：1.收集不同方式或藥物處理的細(xì)胞，調(diào)整濃度為1-5×1072.預(yù)冷結(jié)合緩沖液（可置冰上）洗滌兩次（1000r/min,5min）3.用250ul結(jié)合緩沖液重懸，使細(xì)胞濃度為1×1074.取100ul置于流式樣品管，加5ulAnnexin-V和PI，避光孵育15min5.加入400ulPBS，選擇合適波長(zhǎng)測(cè)定正常細(xì)胞：V（-）PI（-）早期凋亡：V（+）PI（-）

晚期凋亡或壞死：V（+）PI（+）依據(jù)：正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞胞膜完整，故PI拒染；正常活細(xì)胞PS不外翻，故Annexin-V拒染，胞膜完整，PI拒染；晚期及壞死細(xì)胞膜受損，PS外翻，二者均染色結(jié)果判定：檢測(cè)結(jié)果：I：晚期凋亡細(xì)胞II：早期凋亡細(xì)胞III：活細(xì)胞IIIIII注意事項(xiàng)：1.操作中動(dòng)作輕柔，低速離心，勿用力吹打細(xì)胞，盡量冰上操作2.與熒光染料反應(yīng)完盡快檢測(cè)，1h后熒光衰減3.AnnexinV-FITC和PI是光敏物質(zhì)，操作時(shí)避光4.試劑作用時(shí)間的影響5.PI能透皮吸收，勿直接接觸5.凋亡細(xì)胞內(nèi)游離Ca離子濃度檢測(cè)原理：細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca離子濃度急劇升高。Ca離子熒光指示劑Fluo-3/Am與細(xì)胞內(nèi)Ca離子特異結(jié)合，當(dāng)用488nm激發(fā)光激發(fā)時(shí)，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)游離Ca離子濃度成正比。方法（略）五、常用單細(xì)胞分離技術(shù)指從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞使其在體外繁殖成新的細(xì)胞群體。用于細(xì)胞純化及比較不同亞群的形態(tài)和功能。方法：有限稀釋法、平皿克隆分離法、軟瓊脂克隆分離法。1.有限稀釋法方法：細(xì)胞梯度倍比稀釋，接種于微孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)一段時(shí)間后，分離細(xì)胞克隆。用途：細(xì)胞同質(zhì)化、分離耐藥或突變細(xì)胞株、分離單克