頭C發(fā)酵進展課件

頭孢菌素C發(fā)酵相關(guān)進展一.前言二.發(fā)酵歷史沿革三.目前生產(chǎn)技術(shù)現(xiàn)狀四.技術(shù)前沿五.一.前言頭孢類藥物是抗生素類藥物中最重要的藥物之一，其市場份額已占到抗生素類藥物物市場份額的一半以上。7-氨基頭孢烷酸（7-ACA)作為合成頭孢類藥物的三大基本母核之一（7-ACA，7-ADCA，GCLE），雖然全化學(xué)合成方法早已經(jīng)成功，但由于成本原因，目前工業(yè)上7-ACA主要是由頂頭孢霉菌產(chǎn)生的頭孢菌素C經(jīng)化學(xué)或酶法裂解生產(chǎn)的。二.發(fā)酵歷史沿革1945年，意大利科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生廣譜抗菌活性物質(zhì)的一株頂頭孢霉菌；1953年，從這一霉菌的發(fā)酵液中分離到化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于青霉素的第二類&-內(nèi)酰胺抗生素----頭孢菌素C，對金黃色葡萄球菌的抗菌活性，頭C的抗菌活性只及青霉素N的1％，青霉素N只及青霉素的10％，由于其抗菌活性低，而未能直接用于臨床。二.發(fā)酵歷史沿革最初的原始菌株產(chǎn)生頭C的能力很低，效價只有十幾個單位。為了得到生產(chǎn)能力更高的菌株，各國科學(xué)家對菌株進行了反復(fù)的誘變、篩選，使菌種的生產(chǎn)能力不斷提高。頂頭孢霉M8560是用于工業(yè)生產(chǎn)的原始親株，全世界所有高產(chǎn)菌株差不多都是由它反復(fù)誘變、篩選得到的。目前，發(fā)酵單位最高水平已接近4萬（全液效價）。二.發(fā)酵歷史沿革經(jīng)長期的遺傳改良，產(chǎn)生頭C的頂頭孢霉在平板上生長的菌落呈現(xiàn)出以下特點：直徑縮小（由10—15mm縮至3—5mm）、隆起高了將近1/4、顏色變淺，生長速度變慢，生長周期延長至4—7天，另外隨著生產(chǎn)能力的提高，菌株產(chǎn)生孢子能力有出現(xiàn)退化的趨勢，從而不利于菌種的保存。二.發(fā)酵歷史沿革青霉素是是世界上第一個進行工業(yè)化生產(chǎn)的抗生素品種，目前青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝已經(jīng)比較完善，已經(jīng)實現(xiàn)了計算機自動化控制。頭C發(fā)酵生產(chǎn)工藝受青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝影響比較大。如上世紀70年代，分批補料半連續(xù)發(fā)酵工藝在青霉素生產(chǎn)中研制成功并用于大生產(chǎn)。受此啟發(fā)，上世紀90年代，分批補料半連續(xù)發(fā)酵工藝在頭孢菌素C發(fā)酵生產(chǎn)中成功運用，單罐產(chǎn)量得到大幅度提高，一是表現(xiàn)在放罐效價的提高，二是表現(xiàn)在放罐體積的增大。二.發(fā)酵歷史沿革頭C生物合成途徑及一些調(diào)控機制已經(jīng)闡明。蛋氨酸的誘導(dǎo)作用及誘導(dǎo)機制被發(fā)現(xiàn)并成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。另外，也選育出了不需要添加蛋氨酸的高產(chǎn)菌株。目前生產(chǎn)技術(shù)現(xiàn)狀自70年代以來，英國、日本、荷蘭等國相繼研發(fā)酶法7—ACA生產(chǎn)工藝（指由頭C到7-ACA的轉(zhuǎn)化），目前國外已全部實現(xiàn)了酶法7—ACA的工業(yè)生產(chǎn)，國內(nèi)的生產(chǎn)廠家也正逐步由化學(xué)裂解法向酶法生產(chǎn)7—ACA改進。目前生產(chǎn)技術(shù)現(xiàn)狀目前，頭C的發(fā)酵大致劃分為兩種類型：一種是低菌濃、短周期、低單位、高質(zhì)量的發(fā)酵液、高收率的發(fā)酵類型；二是高菌濃、長周期、高單位、收率相對略低的發(fā)酵類型。國內(nèi)廠家多采用前一種發(fā)酵類型，周期120—140小時，一般為130小時左右，放罐菌濃45—52％，而國外大多數(shù)廠家，一般采用后一種類型，周期160—180小時，放罐菌濃60—65％.目前生產(chǎn)技術(shù)現(xiàn)狀產(chǎn)能情況將在下一部分討論。四.技術(shù)前沿1.菌種的選育菌種是影響頭C發(fā)酵水平的第一位因素，一直是人們研究的熱點。篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變菌株、去碳源調(diào)節(jié)突變菌株、去銨離子調(diào)節(jié)突變菌株、前體抗性突變菌株、自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變菌株是目前人們研究的方向。目前，已經(jīng)利用傳統(tǒng)育種技術(shù)選育出了不需要添加蛋氨酸，能夠直接代謝無機硫的頭C生產(chǎn)菌，如能推向工業(yè)生產(chǎn)，將成為降低發(fā)酵成本的一大亮點。技術(shù)前沿雖然誘變育種仍然是目前微生物發(fā)酵工業(yè)的重要育種手段，但它的盲目性決定了其低效性，同時目前的菌種是由野生菌種經(jīng)長期反復(fù)誘變篩選得到的，依靠傳統(tǒng)的育種方法來大幅度提高生產(chǎn)菌種的生產(chǎn)能力已經(jīng)變得越來越困難。技術(shù)前沿目前，利用基因重組技術(shù)改良抗生素的生產(chǎn)菌主要在以下幾個方向：（1）、提高限速酶活力，解除抗生素生物合成中的限速步驟，改變細胞內(nèi)代謝流的方向，提高抗生素的產(chǎn)量；（2）、引入抗性基因，增加抗性基因拷貝數(shù)，提高產(chǎn)生菌自身耐受性；（3）、引入氧結(jié)合蛋白來提高氧的利用率；（4）、增強正調(diào)控或解除負調(diào)控基因的阻遏作用；通過敲除或破壞次要組分的生物合成基因來消除或減少次要組分。技術(shù)前沿1-1.分析頭C工業(yè)菌株發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)有青霉素N積累，表明合成途徑中的下一步反應(yīng)限制了這一中間體的轉(zhuǎn)化。禮來公司與牛津大學(xué)合作構(gòu)建了頭C產(chǎn)生菌的工程菌，其中一個轉(zhuǎn)化子增多了一個拷貝的擴環(huán)酶基因，結(jié)果工程菌的發(fā)酵液中擴環(huán)酶的活性增加、青霉素N的濃度減少、最終CPC的產(chǎn)量增加了15％。這說明工程菌中已有效解除了頭孢菌素C生物合成中的限速步驟，使青霉素N向脫乙酰氧頭孢菌素C、脫乙酰頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化反應(yīng)不再成為限速瓶頸。技術(shù)前沿1-3.在頭C的生物合成途徑中，有三步反應(yīng)需要氧的參與，即環(huán)化反應(yīng)、擴環(huán)反應(yīng)、羥化反應(yīng)，因此頭C發(fā)酵過程對氧的需求條件比其他抗生素發(fā)酵要求得更嚴苛，供氧不足，將直接影響發(fā)酵水平。目前一般通過增加攪拌功率、增大空氣流量、提高罐壓來解決，但會帶來動力成本的大幅度增加。將一種絲狀細菌透明顫菌的血紅蛋白基因克隆到頭C工程菌中，在細胞中表達血紅蛋白，提高氧的利用效率，具有良好的應(yīng)用前景。技術(shù)前沿1-4.調(diào)節(jié)基因的作用可以增加或降低抗生素的產(chǎn)量，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因簇的組成部分。通過增加正向調(diào)節(jié)基因或減少負向調(diào)節(jié)基因，對結(jié)構(gòu)基因進行正向調(diào)節(jié)，加速抗生素的產(chǎn)生。各種代謝產(chǎn)物都是通過酶的催化來形成的，而酶的產(chǎn)生又是受到相關(guān)基因的調(diào)控的，因此可以通過破壞分支途徑的生物合成基因或破壞次要組分的生物合成基因，使發(fā)酵過程朝利于產(chǎn)生頭C的方向進行，提高原料利用率，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生量。技術(shù)前沿2.連續(xù)發(fā)酵工藝的研究。技術(shù)前沿列現(xiàn)代控制理論，如靜態(tài)與動態(tài)優(yōu)化、系統(tǒng)識別、自適應(yīng)控制、專家系統(tǒng)、模糊控制、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)等，都是基于發(fā)酵過程中各參數(shù)的高度非線性的特征而設(shè)計的。如神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，是模擬人的大腦的思維方式來進行控制，在大量生產(chǎn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過對這些數(shù)據(jù)的“學(xué)習(xí)”,建立起和最優(yōu)化生產(chǎn)工藝高度擬合的自動化控制系統(tǒng)，避免人為控制的隨意性，但目前離實際應(yīng)用還有一定距離。。技術(shù)前沿有些廠家已安裝了尾氣分析儀，對攝氧率、二氧化碳釋放率、呼吸商等參數(shù)進行在線檢測，并利用相關(guān)軟件進行處理分析，為頭C的自動化控制奠定了基礎(chǔ)技術(shù)前沿5.頭C向7—ACA轉(zhuǎn)化方法的研究。5—1.前面已提到，酶法7—ACA在國外已完全取代化學(xué)裂解法，國內(nèi)廠家也逐步改用酶法生產(chǎn)。酶法7—ACA目前有兩種工藝，一種是兩步酶法，第二種是一步酶法。兩種方法各有所長，一般采用兩步酶法，較成熟。技術(shù)前沿兩步酶法是利用D—氨基酸氧化酶（由可變?nèi)墙湍府a(chǎn)生）對頭C進行脫氨反應(yīng)，生成GL—7—ACA，然后在GL—7—ACA酰化酶的催化下，脫去戊二酸生成7—ACA；一步法是直接利用頭孢菌素酰化酶催化生產(chǎn)7—ACA。技術(shù)前沿5—2.固定化細胞技術(shù)也是很有前途的研究方向。技術(shù)前沿5—3.7—ACA的直接發(fā)酵生產(chǎn)。日本科學(xué)家將假單孢菌SE—83、缺陷假單孢菌—V22中的?；富蚩寺〉筋^C產(chǎn)生菌中，改造菌在產(chǎn)生頭C的同時，將部分頭C脫酰基生成7—ACA，從而使直接發(fā)酵生產(chǎn)7—ACA成為可能。五.我集團生產(chǎn)情況介紹及與市場*

情況分析。1.產(chǎn)能原來60噸左右，技改后70噸左右（指頭C）。以后達80噸以上。2.上馬酶法7-ACA車間。今后酶法裂解和化學(xué)裂解法同時運用。3.噴霧干燥代替結(jié)晶法。收率提高8％，溶媒節(jié)省，轉(zhuǎn)化率提高（頭C→7-ACA）。4.濾液十億原來2400左右，現(xiàn)在正常達2800以上，高者超過3000.發(fā)酵水平居國內(nèi)領(lǐng)先水平，發(fā)酵指數(shù)大于1.8。（十億3021--→31500）我集團生產(chǎn)情況介紹及與市場情況分析韓國生產(chǎn)數(shù)據(jù)：濾液效價49787，全液32989。發(fā)酵周期160小時國內(nèi)最高據(jù)稱：濾液效價42000，折合全液大約27836（十億2672+130帶放十億=2800）（120立方數(shù)據(jù)）我集團生產(chǎn)情況介紹及與市場情況分析5.產(chǎn)能情況。（最新數(shù)據(jù)）目前7-ACA主要供應(yīng)商中,企業(yè)的產(chǎn)能分別為:中潤藥業(yè)1500噸(實際產(chǎn)量1000噸,下同),健康元1200噸(900噸),福州抗生素集團1000噸(750噸),山西威奇達1000噸(500噸),哈藥集團900噸(750噸),魯抗醫(yī)藥600噸(550噸)及聯(lián)邦制藥500噸(500噸)。2010年國內(nèi)7-ACA理論產(chǎn)能為7600噸,實際產(chǎn)量在5500噸左右。我集團生產(chǎn)情況介紹及與市場情況分析從2010年下半年開始,各大企業(yè)的7-ACA巨資項目陸續(xù)開工及投產(chǎn)的消息不斷傳出。上述企業(yè)中,健康元已經(jīng)宣布將擴大產(chǎn)能,達到1800噸,而聯(lián)邦制藥也明確將擴產(chǎn)達1200噸,魯抗醫(yī)藥已經(jīng)擴產(chǎn)達900噸。此外,華藥6-APA車間改造轉(zhuǎn)產(chǎn)7-ACA已經(jīng)完成,并將投入11億元用于擴產(chǎn),最終將實現(xiàn)產(chǎn)能3000噸;悅康的7-ACA項目產(chǎn)能達2000噸;立海潤7-ACA項目產(chǎn)能達1000噸等。我集團生產(chǎn)情況介紹及與市場情況分析這些項目都將在今年內(nèi)投產(chǎn)。由此導(dǎo)致國內(nèi)理論產(chǎn)能至少增加7600噸,國內(nèi)總產(chǎn)能超過15000噸。2010年7-ACA最高價格一度攀升超過1000元/公斤,市場需求十分旺盛。即使在企業(yè)逐漸加大開工率、恢復(fù)產(chǎn)能的情