動物球蟲病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

動物球蟲病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙??熟悉球蟲卵囊的形態(tài)特征。掌握分離球蟲卵囊的方法。了解常見球蟲的種類。熟悉雞球蟲感染后的病變記分和糞便記分方法。二、 實(shí)驗(yàn)器材1?儀器設(shè)備。上海XSP-2C生物顯微鏡(具備10倍目鏡和低倍、高倍物鏡及油鏡)目鏡測微尺和物鏡測微尺；蓋玻片、載玻片、牙簽、洗瓶、平皿；剪刀及手術(shù)刀；離心管；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。2?實(shí)驗(yàn)材料。感染球蟲的患雞，常見的球蟲卵囊，蔗糖、食鹽、硫酸鎂、鉻硫酸、重鉻酸鉀等。三、 實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)(一)球蟲的形態(tài)觀察隨宿主糞便排出的卵囊呈卵圓形、圓形或球形；無色、淡黃色或淡綠色，其形態(tài)大小隨球蟲種類而異。外被有兩層囊壁，外壁較厚，輪廓清晰；內(nèi)壁較薄。內(nèi)含顆粒狀的胞質(zhì)即原生質(zhì)團(tuán))。卵囊內(nèi)具有一至多個(gè)抱子囊，每個(gè)抱子囊內(nèi)含有一至多個(gè)子抱子，因種類而異。艾美耳屬的球蟲種類經(jīng)發(fā)育后，原生質(zhì)團(tuán)分裂為四個(gè)抱子囊，每個(gè)抱子囊內(nèi)含有兩個(gè)子抱子。有些種類的球蟲在卵囊的極端具有明顯的卵膜孔，有些球蟲的卵囊內(nèi)膜突出于卵膜孔之外，形成極帽。畜禽常見球蟲的種類：牛球蟲。文獻(xiàn)報(bào)道的有10種，其中9種為艾美耳屬(Eimeria)球蟲，另外一種為阿沙卡等抱球蟲(Isosporaakscaica)以邱氏艾美耳球蟲(E.zurnii)致病力最強(qiáng)，牛艾美耳球蟲(E.boviS)致病力較強(qiáng)，它們寄生于牛消化道的上皮細(xì)胞。邱氏艾美耳球蟲(E.zurnii)。卵囊呈亞球形或球形，平均直徑為18.6pmX14.6pm。淡黃色，無卵膜孔，胞質(zhì)充滿整個(gè)卵囊，無極體。卵囊抱子化時(shí)間為24~72小時(shí)。牛艾美耳球蟲(E.bovis)。卵囊呈卵圓形，褐色，有卵膜孔，平均大小27.7pmX20.3pm，卵囊抱子化時(shí)間為48?72小時(shí)。兔球蟲。種類很多，有16種，屬艾美耳屬。僅介紹兩種如下。斯氏艾美耳球蟲(E.stiedae。寄生于肝、膽管上皮細(xì)胞內(nèi)。致病力最強(qiáng)。卵囊甚大，長橢圓形，大小為26?40pmX16?25pm,略帶淡紅色，囊壁較厚，具卵膜孔。穿孔艾美耳球蟲(E.perforans。寄生于腸上皮細(xì)胞內(nèi)。卵囊甚小，橢圓形，兩端較鈍，無色，大小為13.3?30.6pmX10.6?17.3pm,卵膜孔不明顯。雞球蟲。報(bào)道的有9個(gè)種，屬艾美耳屬，世界公認(rèn)的有7個(gè)種。柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella。寄生于盲腸，多為寬卵圓形，少數(shù)為橢圓形，原生質(zhì)呈淡褐色，卵囊壁為淡黃綠色(圖17T)。其卵囊平均大小為22pmX19pm,形狀指數(shù)為1.16，裂殖體很大，直徑可達(dá)54pm，第一代裂殖體包含的裂殖子可達(dá)900個(gè)，第二代為350個(gè)，最短抱子化時(shí)間為18h，最短潛隱期為115h。圖17-1柔嫩艾美耳球蟲卵囊毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)。其第一、二代裂殖生殖在雞小腸，第三代裂殖生殖和配子生殖在盲腸。卵囊呈卵圓形，大小為13.2?22.7pmX11.3?18.3pm,囊壁無色、光滑。具極粒，抱子囊呈卵圓形，有斯氏體，無殘?bào)w(見圖17-2)。圖17-2毒害艾美耳球蟲卵囊堆型艾美耳球蟲(E.acervulin)寄生于十二指腸。卵囊呈卵圓形，大小為17.7?20.2》mX13.7?16.3pm。光滑，卵囊壁淡黃綠色。抱子囊呈卵圓形，有斯氏體，具極粒，無殘?bào)w(圖17-3)。圖17-3堆型艾美耳球蟲卵囊布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)。寄生于小腸后段、直腸和盲腸近端區(qū)。卵囊平均大小為18.8pmX24.6pm,是雞球蟲中僅次于巨型艾美耳球蟲的第二大型卵囊。形狀指數(shù)為1.31。有一極粒，無殘?bào)w和卵膜孔。裂殖體直徑為30pm。抱子化時(shí)間為18h，潛隱期為120h0巨型艾美耳球蟲(E.maxims)。寄生于小腸中段。卵囊很大，是雞球蟲中最大型的卵囊，最大的卵囊達(dá)到42.5|Jm?29.8pm。卵囊呈卵圓形，一端鈍圓，一端較窄，黃褐色，囊壁淺黃色。其形狀指數(shù)為1.47。最大的裂殖體直徑為9.4pm。(圖17-4)。圖17-4巨型艾美耳球蟲卵囊

和緩艾美耳球蟲(E?mitis)。寄生于雞小腸前段。卵囊較小，近球形，卵囊壁為淡黃綠色，有一極粒，無卵膜孔，也無殘?bào)w。卵囊平均大小為15.6pmX14?2p 最短抱子化時(shí)間為15h?(圖17-5)。圖17-5和緩艾美耳球蟲卵囊早熟艾美耳球蟲(E.praecox)。寄生于小腸上段1/3處。卵囊呈卵圓形或橢圓形，平均大小為21?3pmX17?lpm,形狀指數(shù)為1.24，囊壁光滑，呈淡黃綠色，原生質(zhì)無色，無卵膜孔和殘?bào)w,具極粒。抱子囊無殘?bào)w。(圖17-6)。圖17-5和緩艾美耳球蟲卵囊圖17-6早熟艾美耳球蟲卵囊鴨球蟲。鴨球蟲常見于北京鴨群中，對北京鴨具有致病力的球蟲有兩種。(圖17-7)。毀滅泰澤球蟲(Tyzzeriaperniciose)。寄生于小腸前段，致病力強(qiáng)。卵囊呈短橢圓形，較小，呈淡綠色，，大小為13.2?9?2pmX9.9?7?2pm,形狀指數(shù)為1.2。無抱子囊，8個(gè)子抱子呈香蕉狀，大小為7.2pmX2?7pm。菲萊氏溫楊球蟲(Wenyonellaphiliplevine)寄生于小腸，致病力弱。卵囊呈卵圓形，淺淡綠色，外層薄而透明，內(nèi)層淺藍(lán)，大小為22?13pmX12?10pm,有卵膜孔，形狀指數(shù)為1.5。抱子囊呈瓜子形，大小為7.2pmX4?8pm,具斯氏體。圖17-7鴨球蟲卵囊1?毀滅泰澤球蟲2.菲萊氏溫楊球蟲(二)卵囊的分離與孢子化卵囊的分離。卵囊存在于宿主糞便和組織中。分離糞便中的卵囊較多采用飽和食鹽(或硫酸鎂、蔗糖等)溶液漂浮法和離心法；分離組織中的卵囊一般采用鉻硫酸分離法和蛋白酶消化法。單卵囊分離法是指從混合蟲種的卵囊中分離出單個(gè)卵囊，以備進(jìn)一步擴(kuò)增所需的“克隆”卵囊。盡管有許多分離卵囊的方法，但其基本原理是一樣的，即根據(jù)卵囊與雜質(zhì)比重的不同。對于組織中的卵囊，尚需借助消化液或酸的作用，破壞組織中的細(xì)胞，以利卵囊的提純。(1)漂浮法?？捎煤芏喾N溶液和很多種方法，其關(guān)鍵是溶液的比重要適當(dāng)(一般1.2左右)；再者，溶液對卵囊的活性沒有不良影響。這里介紹幾種常用方法：糖溶液漂浮法。糖溶液的制備。稱500g糖和6.5g石碳酸(或6?7ml石碳酸溶液)溶于320ml蒸餾水中即可。此法配制的溶液也常稱為Sheather氏糖溶液。卵囊的分離。在一容器里將糞便和2倍于糞便體積的自來水(或生理鹽水，或食用專用洗劑如0.5%萊噴液等)混成均勻的懸浮液。將糞便混懸液經(jīng)兩層粗棉布(或先經(jīng)50目后經(jīng)100?200目網(wǎng)篩)濾到第二個(gè)容器中，再與等量Sheather氏糖溶液混合，而后將混合液注入離心管中。離心(3000rpm,3min)。用直徑略小于離心管口徑的撈網(wǎng)(20?50目)撈取表層浮液，抖落于另一盛水容器中。水的多少視卵囊的多少而定，卵囊多帶進(jìn)的糖溶液也多，應(yīng)多加水稀釋。離心(3000rpm,3min)，沉淀物即為所需卵囊。飽和食鹽溶液漂浮法。飽和食鹽溶液的配制。在1000m1開水中加食鹽380g，充分?jǐn)嚢?，比重約為1.18。卵囊的分離。將糞便和5倍于糞便體積的生理鹽水?dāng)嚦苫鞈乙骸⒓S便混懸液經(jīng)兩層粗棉布(或先經(jīng)50目后經(jīng)100?200目網(wǎng)篩)濾過到第二個(gè)容器中，并將第二個(gè)容器中的濾過液倒入離心管中。離心(3000rpm,3min)，棄去上清液。向沉淀中加入10倍的飽和鹽水(先加少許，充分混勻后再加其余的)充分混勻。離心(3000rpm,3min)。同糖溶液漂浮法，撈取表層浮液，離心取沉淀。飽和硫酸鎂溶液漂浮法。飽和硫酸鎂溶液的配制。稱64.4g硫酸鎂于1000m1溫水中充分?jǐn)嚢枞芙饧闯伞Ｂ涯业姆蛛x。步驟同前法，只是懸浮液換為飽和硫酸鎂溶液而已。鴨球蟲的兩個(gè)種：菲萊氏溫?fù)P球蟲和毀滅泰澤球蟲的卵囊在飽和食鹽水中較易變形，以此法分離為佳。鉻硫酸分離法。適用于從腸內(nèi)容物、腸粘膜組織、肝組織、腎組織及其它組織中分離球蟲卵囊。無菌條件下操作時(shí)所制備的卵囊為無菌卵囊。鉻硫酸溶液的制備。先配好20%的重鉻酸鈉溶液100ml于500ml錐形瓶中，然后在冰浴條件下逐漸加入濃硫酸100m1，邊加邊充分?jǐn)嚢琛Ｓ貌Ａн^濾器或離心方法除去其它結(jié)晶，即為所需鉻硫酸液。卵囊的分離。將組織或腸內(nèi)容物放在乳缽中充分研碎，加水充分?jǐn)嚢韬箅x心(1500rpm，5min)。向沉淀物中加入4?5倍鉻硫酸溶液，冰浴條件下充分?jǐn)嚢?，然后立即離心(1500rpm，5min)。將浮液中的卵囊用吸管吸出，加入20倍以上的冷卻水(冰水)，離心(1500rpm,5min)，沉淀物即為卵囊。(2)蛋白酶消化法。在分離組織中的卵囊時(shí)，常有許多組織碎塊或細(xì)胞團(tuán)塊混雜于卵囊中或粘附卵囊壁上，致使純化工作十分棘手。在搗碎的組織中加入0.5%?1%胰蛋白酶，將pH調(diào)到&0,39°C下消化20min；或者加入0.2%胃蛋白酶(蔣建林、蔣金書，1996),將pH調(diào)至2.0,在39°C下消化lh,使卵囊分散游離出來，再依次用200目、300目和400目網(wǎng)篩過濾，濾液經(jīng)2000rpm,10min離心沉錠，棄掉上清液，在沉淀中加入1M蔗糖溶液，2000rpm，10min離心，管上層漂浮的白色似“塞子狀”的物質(zhì)即為卵囊。將其移入裝有0.5M蔗糖溶液小離心管中，2000rpm離心10min沉淀，重復(fù)幾次充分洗滌除去比重較小的雜質(zhì)，然后加入5%次氯酸鈉，在4C下作用10min，最后在低濃度(0.5M)的蔗糖溶液中離心洗滌，除去小的雜質(zhì)和次氯酸鈉，即可得純化的未抱子化卵囊。糖溶液梯度離心法。適用于從少量溶液中分離卵囊。糖溶液的制備。將128g精制白糖溶解于100m1水中，以此作為總量，加入0.5%石碳酸，混勻作為A液。以A液為基礎(chǔ)，再按下述混合比，制成B、C、D液。B液：3份A液+1份水，充分混合C液：3份B液+1份水，充分混合D液：3份C液+1份水，充分混合梯度離心管的裝備。用10?50m1的離心管，從底部開始，輕輕將等量的A、B、C、D液分層次地依次加入管中。這幾種液體不得相互摻混。卵囊的分離。將糞便混勻在5倍體積的水中，離心(1000rpm,3min)，棄去上清液。沉淀物加1/2體積的水,混勻后取少量放置在D液的上部，厚度約為1cm。離心(1000rpm,3min)。用吸管將液層上部的液體吸掉，只將D液層(含卵囊)移入另外的離心管中，用大約10倍的水稀釋后，離心(2000rpm,5min)。沉淀物即為卵囊。單卵囊分離(擴(kuò)增)法。稀釋法。將糞便或組織搗碎物混勻在20倍體積的2.5%重鉻酸鉀溶液中，置25?27C下培養(yǎng)2?7天，至95%的卵囊抱子化。培養(yǎng)物經(jīng)3層紗布或50目網(wǎng)篩過濾。用干凈的滴管吸取濾過物一小滴于載玻片上，并加一滴生理鹽水稀釋,使在低倍顯微鏡下觀察時(shí),一個(gè)視野只有1?2個(gè)卵囊。在顯微鏡下，右手持玻璃毛細(xì)吸管的尖端正對視野中的一個(gè)卵囊時(shí)，將吸管向卵囊直伸過去，卵囊隨溶液吸入毛細(xì)吸管內(nèi)。把毛細(xì)吸管中的液體吹落到鋪有薄層瓊脂的載玻片上，在顯微鏡下觀察，確證是一個(gè)卵囊時(shí)，單卵囊分離即告完畢。分離單卵囊的目的是為了進(jìn)一部擴(kuò)增其“克隆”卵囊，操作步驟如下：用細(xì)的解剖刀將玻片上含有單卵囊小滴液的瓊脂周圍劃破，以小滴液為中心，將前后左右的瓊脂薄膜摺疊覆蓋起來。將包有卵囊的瓊脂團(tuán)小心地喂給一日齡的雛雞。感染后，雛雞需隔離飼養(yǎng)。于感染后第2天開始，每天檢查糞便，觀察有無卵囊排出。收集糞便中的克隆卵囊。顯微操作器分離法。高級顯微鏡都有顯微操作器，可在顯微視野下方便地吸取所需的單個(gè)卵囊或其它發(fā)育階段的球蟲(如抱子囊，子抱子，裂殖子，裂殖體，配子和配子體等)。抱子化。卵囊抱子化需要合適的溫度和濕度及充足的氧氣?？梢栽诜蛛x卵囊前也可在分離卵囊后進(jìn)行。因?yàn)殡s質(zhì)的存在影響氧氣的擴(kuò)散，致使卵囊攝入氧不足,發(fā)育不良；加上培養(yǎng)(孵化)卵囊時(shí)，細(xì)菌的生長常常競爭消耗氧氣，所以，用水培養(yǎng)卵囊時(shí)應(yīng)添加青霉素和鏈霉素(1000IU/ml),或者用具抑菌作用的液體來培養(yǎng)。最好的培養(yǎng)液是2.5%的重鉻酸鉀液。向盛有分離卵囊的平皿中加入一定量的培養(yǎng)液，放在25?28°C的恒溫箱中培養(yǎng)1?7天。此間每天應(yīng)對培養(yǎng)液輕輕攪拌3?5次，并觀察抱子發(fā)育情況，當(dāng)有80%以上的卵囊完成抱子化時(shí)，停止培養(yǎng)。完成抱子化的卵囊(或稱成熟卵囊、感染性卵囊、抱子化卵囊)內(nèi)含有4個(gè)抱子囊，抱子囊前端的斯氏體清晰可見，抱子囊內(nèi)的2個(gè)子抱子的折光體也清楚。如果有加氧器，則可以用生理鹽水瓶或其它容器培養(yǎng)。抱子化卵囊應(yīng)放入10倍體積以上的2.5%的重鉻酸鉀液中，低溫3?7C下保存。在這種條件下，卵囊的感染性可保持一年以上。(三)雞球蟲病的診斷技術(shù)1?卵囊計(jì)數(shù)方法。主要用于計(jì)算克糞便和克墊料中球蟲卵囊數(shù)值 (OPG)或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)收集的卵囊懸液和球蟲疫苗保存液中的卵囊數(shù)值。常用方法有以下幾種：(1)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。方法是稱取1g雞糞，溶于10m1水中制成10倍的稀釋液，經(jīng)充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，取?滴置血球計(jì)數(shù)板中,在低倍鏡下計(jì)算計(jì)數(shù)室四角4個(gè)大方格(每個(gè)大方格又分為16個(gè)中方格)中球蟲卵囊總數(shù)，除以4求其平均值，乘104即為1ml液體的卵囊數(shù)。然后乘10即為OPG值。如果計(jì)數(shù)室四角沒有大方格則用正中的一個(gè)大方格，連數(shù)幾次，求其平均數(shù)，乘105即為OPG值。計(jì)算公式：OPG=aX10X1/(0.1X0.1X0.01)=aX105(2)載玻片計(jì)數(shù)。從上述的10倍稀釋液中，取出0.05ml置于載玻片上，再覆加蓋玻片，計(jì)數(shù)整個(gè)蓋玻片內(nèi)的卵囊。計(jì)算公式：OPG=bX10X1/0.05=bX200浮游生物計(jì)算板計(jì)數(shù)。從上述的10倍稀釋液中，吸取0.04m1,滴于浮游生物計(jì)算板中，覆加32mmX28mm的蓋玻片，然后數(shù)出64列中的10列所見到的卵囊數(shù)。計(jì)算公式：OPG=cX10X1/0.04X64/10=cX1600注：a、b、c為數(shù)到的卵囊數(shù)。麥克馬斯特法(McMaster'smethod)。計(jì)數(shù)時(shí)取糞便2g置研缽中，先加入10m1水，攪勻，再加飽和鹽水溶液50m1，混勻后立即吸取糞液充滿兩個(gè)計(jì)數(shù)室，靜置1?2min,鏡檢計(jì)數(shù)兩個(gè)計(jì)數(shù)室的卵囊數(shù)。計(jì)數(shù)室容積為1X1X0.15=0.15m1,0.15ml內(nèi)含糞便2/(10+50)X0.15=0.005g，兩個(gè)計(jì)數(shù)室則為0.01g。故所得卵囊數(shù)乘100即為OPG值。計(jì)算公式：OPG=aXl00鉻硫酸卵囊計(jì)數(shù)法。先向2?5g雞糞中加入20?30ml的水，經(jīng)充分?jǐn)嚢韬?，取?m1放入帶刻度的離心管中(10ml裝)，進(jìn)行離心(2000rpm,5min)。離心后除去上清液，測出糞的容量。用10倍的鉻硫酸溶液(20%重鉻酸鈉溶液，加入等量的硫酸，再用玻璃濾器將析出的結(jié)晶除去后的濾液)稀釋，用水管的流水不斷冷卻離心管的外壁，再向糞液中加入鉻硫酸溶液，充分?jǐn)嚢琛Ｒ虿僮鬟^程發(fā)生氣泡，故靜置5min使氣泡釋出后檢查為宜。此外，由于雛雞個(gè)體的糞便狀態(tài)不盡相同，例如從糞便排出到采樣的間隔時(shí)間所致干燥程度上的差異及癥狀輕重不同所致水分含量的差異等條件，對通過稱量雞糞計(jì)算OPG值具有明顯影響。為此，可以采用以下方法：先將雞糞便溶于適量水中，再將糞液放入帶有刻度的離心管中，通過離心(2000rpm,5min),舍去上清液，通過離心管上的刻度測出沉渣的容量，再重新加水制成0倍的稀釋液，然后計(jì)算卵囊的數(shù)量。雞球蟲各發(fā)育階段蟲體的檢查。在腸組織或糞便涂片上證實(shí)確有蟲體(子抱子，滋養(yǎng)體，裂殖子，裂殖體，大、小配子體，大、小配子，合子，卵囊)存在，便可確診為球蟲感染；而根據(jù)雞群的表現(xiàn)，諸如生產(chǎn)性能、臨床癥狀和病變記分等，以及每克糞便或墊料中的卵囊數(shù)，便可判斷雞群是僅僅有球蟲感染，還是在流行亞臨床型或臨床型球蟲病。(1)具體操作。用小型外科刀從最顯著的感染區(qū)域取材，并在所有病例中從每一處至少取兩個(gè)樣品，一個(gè)取自粘膜表層，另一個(gè)取自粘膜的深處。淺層刮取物的顯微鏡觀察應(yīng)該查到卵囊或其它階段蟲體，深層刮取物應(yīng)該查到內(nèi)生發(fā)育階段的蟲體。顯微鏡檢查結(jié)果可用于確定引起感染的艾美耳球蟲種。對蟲體內(nèi)生階段形態(tài)不熟悉的診斷人員，最好先做涂片進(jìn)行姬姆薩染色。(2)各階段蟲體形態(tài)簡述。子抱子呈香蕉形，其最顯著和最典型的結(jié)構(gòu)是折光體。通常有2個(gè)折光體，一前一后。結(jié)構(gòu)致密、勻質(zhì)、無界膜。折光體大小可以變化，偶爾無前端的折光體。光學(xué)鏡下觀察，折光體發(fā)亮，不透明；染色后，折光體著色深而均勻。滋養(yǎng)體呈圓球形，單個(gè)細(xì)胞核，姬姆薩染色時(shí)，核著色較深呈暗紅色。成熟裂殖體形狀為圓球形，由許多香蕉形裂殖子緊湊地排列組成，類似于剝皮后的桔子外觀。裂殖體成熟后，裂殖子成簇散開。裂殖子一端鈍圓，一端稍尖，單個(gè)細(xì)胞核位于偏中部，胞質(zhì)呈顆粒狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)有空泡。姬姆薩染色后核呈深紅色，胞質(zhì)呈淡紅色。姬姆薩染色涂片上見到的成熟配子體的胞漿內(nèi)含紫色顆粒，大小不等，白色顆粒散在核的周圍，核淺紅色。大配子呈亞球形，細(xì)胞漿中含有一層或兩層嗜酸性顆粒，由粘蛋白組成，鏡下觀察細(xì)胞漿呈大理石狀外觀。成熟小配子體近似球形，內(nèi)含近千個(gè)深紫色眉毛狀小配子，成熟后小配子向外散出，中央留有殘?bào)w。合子呈亞球形，大小與大配子相似，大、小配子結(jié)合后形成合子，此時(shí)大配子細(xì)胞漿中的嗜酸性顆粒即開始向周邊膜下遷移，由于顆粒狀物位于膜下即可與大配子區(qū)別。之后顆粒狀物均勻散開，凝固形成卵囊壁。卵囊呈圓形、橢圓形、卵圓形。囊壁兩層，個(gè)別種較小端有卵膜孔。在組織中的卵囊內(nèi)有顆粒狀的抱子體；墊料及糞便中的卵囊，部分已抱子化，內(nèi)含4個(gè)抱子囊；每個(gè)抱子囊中有2個(gè)子抱子。卵囊鑒定方法。大小。雖然卵囊的大小可能有助于確定種，但也有其局限性；除巨型艾美耳球蟲與和緩艾美耳球蟲之外，單獨(dú)用此特征鑒別蟲種尚有困難。操作者不測算而試圖判別卵囊大小是不現(xiàn)實(shí)的。用目鏡測微尺測大量卵囊后，其大小才是有用的標(biāo)準(zhǔn)。卵囊長、寬的最大值、最小值和平均值均需列出。卵囊大小僅是球蟲種鑒別中幾個(gè)有用特征之一。任何確定種的卵囊大小總有不同，因此對蟲種的任何判斷必須依賴于測量至少50個(gè)卵囊的平均大小。顏色。只有巨型艾美耳球蟲憑其外形和顏色可與其它6個(gè)種區(qū)別開。該種最有用的特征是卵囊醒目的金黃色。其它種是淺綠色或無色。巨型艾美耳球蟲卵囊壁外層有時(shí)局部呈波浪狀，而其它種則光滑。這些特征有助于鑒定出該種。形狀。柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲是長橢圓形到卵圓形；和緩艾美耳球蟲是亞球形到球形。對這些特征必須加以量化(形狀指數(shù))，方能更有助于種的鑒別；其量化的公式如下：形狀指數(shù)=平均長度/平均寬度抱子化時(shí)間。蟲種之間的抱子化時(shí)間應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)溫度下進(jìn)行測定才有比較意義。蟲種最適抱子化溫度在28?30°C的范圍內(nèi)。糞便樣品必須在排出lh內(nèi)收集，卵囊必須經(jīng)過濾和飽和鹽水漂浮后迅速從糞便中分離出來。隨后懸浮在2%?4%重鉻酸鉀溶液的平皿中，在30C下孵育；按規(guī)定時(shí)間間隔在顯微鏡下檢查樣品，當(dāng)發(fā)育完全的抱子囊出現(xiàn)于第一個(gè)卵囊時(shí)記錄抱子化時(shí)間。雞球蟲感染的病變記分。病變的嚴(yán)重性通常是和雞攝入卵囊數(shù)量成比例的，并且是和其它指標(biāo)如增重和記分相關(guān)的。最常用的記分方法是由Johnson和Reid(1970)設(shè)計(jì)的病變記分法。按照這種方法，

把腸道病變分為0?+4五個(gè)等級，0表示正常，+4表示最嚴(yán)重的病變。這一技術(shù)在實(shí)驗(yàn)感染中最為常用，雖然因測定人的不同而有主觀影響，及時(shí)用藥和疫苗接種的雞只評分不準(zhǔn)，但由于其快速、實(shí)用的特點(diǎn)，仍不失為較好的診斷技術(shù)。在試驗(yàn)條件下，卵囊和藥物的劑量都是指定的，蟲種也是已知的。在野外條件下，病變記分對于測量感染的嚴(yán)重性也往往是有用的。即使同時(shí)存在幾種球蟲，通常也只需將小腸分為4段來記分。包括：十二指腸袢的小腸上段；小腸中段，即卵黃蒂上端及下端各10cm的腸道；小腸下段和直腸；盲腸。（1） 混合感染情況下腸道病變記分。0分，無肉眼可見病變；+1分，有少量散在病變；+2分，有較多稀疏的病變，如多處腸區(qū)被感染和由柔嫩艾美耳球蟲感染引起的盲腸出血；+3分，有融合性大面積病變，一些腸壁增厚；+4分，病變廣泛融合，腸壁增厚。柔嫩艾美耳球蟲感染，可見大型盲腸芯，巨型艾美耳球蟲感染,可見腸內(nèi)容物帶血。（2） 單個(gè)蟲種感染情況下腸道病變記分。①柔嫩艾美耳球蟲（感染后5?7天）兩側(cè)盲腸病變不一致時(shí)，以嚴(yán)重的一側(cè)為準(zhǔn)。0分，無肉眼病變+1分，盲腸壁有很少量散在的瘀點(diǎn)，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常。+2分，病變數(shù)量較多，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，盲腸壁稍增厚，內(nèi)容物正常。+3分，盲腸內(nèi)有多量血液或有盲腸芯（血凝塊或灰白色干酪樣的香蕉型塊狀物），腸壁肥厚明顯，盲腸中糞便含量少。+4分，因充滿大量血液或腸芯而盲腸腫大，腸芯中含有糞渣或不含，死亡雞只也記+4分（圖17-8）。+1+3+1+3圖17-8柔嫩艾美耳球蟲病變記分②毒害艾美耳球蟲（感染后5?7天）0分，無肉眼病變+1分，從小腸中部漿膜面看有散在的針尖狀出血點(diǎn)或白色斑點(diǎn)，粘膜損傷不明顯。+2分，從小腸中部漿膜面看有多量的出血點(diǎn)，也可見到中部腸管稍充氣。+3分，小腸腔有大量出血，漿膜面見有紅色或白色斑點(diǎn)。粘膜面粗糙，增厚，有許多針尖狀出血點(diǎn)。腸內(nèi)容物含量少；充氣達(dá)小腸下半段，小腸粗度明顯加大但長度明顯縮小。+4分，小腸因嚴(yán)重出血而呈暗紅色、褐色，大部分腸管氣脹明顯，粘膜增厚加劇，腸腔內(nèi)充滿血液和粘膜組織的碎片，從漿膜面看，在感染部位組織見到白色或紅色病狀，在死亡雞只病灶為白色和黑色，呈“白鹽與黑胡椒”之外觀，有些情況，可見到寄生性肉芽腫，腸管增粗一倍，長度縮短一倍。死亡雞只也計(jì)+4分（圖17-9）。E.necatrtx圖17-9毒害艾美耳球蟲病變記分布氏艾美耳球蟲（第6?7天）0分，無肉眼可見病變+1分，仔細(xì)觀察時(shí)疑有病變。+2分，小腸下段增厚，腸壁呈灰色，從其上可剝下橙紅色物質(zhì)。+3分，小腸壁增厚，有帶血的卡他性滲出物，直腸段有橫向的紅色條紋，病變發(fā)生在盲腸扁桃體時(shí)，有軟的粘液栓。+4分，小腸下段可能出現(xiàn)廣泛的凝固性壞死。病變可能擴(kuò)展到小腸中段或上段。部分雞小腸粘膜面的干性壞死膜可能使小腸出現(xiàn)皺痕以及干酪樣盲腸芯。病死雞也計(jì)4分（圖17-10）。E.brunetti圖17-10布氏艾美耳球蟲病變記巨型艾美耳球蟲（第6?7天）0分，無肉眼可見病變。+1分，小腸中段漿膜面隱約可見出血點(diǎn)，腸腔中有少量桔黃色粘液，腸管形狀不見異常。+2分，小腸中段漿膜面有多量出血點(diǎn)，腸腔中見有多量桔黃色粘液，腸壁增厚。+3分，小腸充氣，壁增厚，粘膜面粗糙，小腸內(nèi)容物含有小血凝塊和粘液。+4分，小腸充氣明顯，腸壁高度增厚，腸內(nèi)容物含有大量血凝塊和紅褐色血液。病死雞只也計(jì)4分（圖17-11）。

圖17-11巨型艾美耳球蟲病變記分堆型艾美耳球蟲（第5~7天）0分，無肉眼可見病變。+1分，十二指腸漿膜面有散在的白色斑，每平方厘米不超過5處。+2分，白色斑增多但不融合，形成白色梯形條紋狀外觀,3周齡以上的雞，病變可擴(kuò)展到十二指腸下20cm，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常。+3分，白色病灶增多且融合成片，小腸壁增厚。內(nèi)容物呈水樣，病變蔓延到卵黃囊憩室之